两种石斑鱼鉴定的DNA标记的研究.pdfVIP

福建覆n’ 第三届海洋生物高技术抡坛 200s．08．19-23 两种石斑鱼鉴定的DNA标记研究3 丁少雄4杜佳莹王世锋陈晓峰 (厦门大学海洋与环境学院，361005) 斜带石斑鱼Epinephelus 斑鱼与点带石斑鱼外型相似，均俗称“青斑”，故两种石斑鱼的形态分类多有混淆，一些石斑 鱼育苗埸将两种石斑鱼亲鱼混养于一池进行人工繁育，使得两种石斑鱼的分类鉴定更为困 难。本文运用几种分子标记技术，在DNA分子水平上对这两种石斑鱼进行鉴别及亲缘关系 分析，以期提供可快速鉴别两种鱼的分子标记，并进一步探讨是否存在斜带石斑鱼与点带石 斑鱼的杂交种，研究结果将对两种石斑鱼种质资源的保护具有重要意义。 1材料与方法 1．1材料 实验所用两种石斑鱼分别采自厦门、海南鱼市场，共计16尾。对实验鱼进行形态学鉴 定后取其肌肉样品浸泡于无水乙醇中，一200C保存待用。 1．2实验方法 1．2．1基因组DNA的提取 采用常规酚．氯仿抽提法【3】o 1．2．2线粒体DNA细胞色素B基因扩增及测序 x30cycles--)72。(3，5min。扩增产物经胶回收纯化，送上海博亚公司测序。 1．2．3 RAPD分析 45s——720C，90s]x45 cycles一720C，5min。 产物在1．5％琼脂糖上电泳，90V恒压电泳2h，0．5 凝胶成像分析系统观察和拍照。 1．2．4 AFLP分析 650C灭活；预扩增反应体系40ul，反应循环 连接酶与人工接头进行链接，370C，连接10h， 3720C，lmin]×25 的条件设置为：940(2，3minlJ【940C，30sf]560C，30sl 3863项目2003AA603011和国家自然科学基助。 4通讯作者：E-mail：sxding@yanan．xmu．edu．ca 430 福建曩n‘ 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19-23 (每个循环降低0．70C)口720c，lmin]×12 x30 cycles。 扩增产物在6％丙烯酰胺7M尿素的变性胶上电泳，80W恒定功率电泳2h，电极缓冲液 为1xTBE，最后进行银染。 1．3数据处理 1．32处理，获得遗传相似率和遗传距离；并通过UPGMA聚类分析， 的检测数据通过popgene 得到两种石斑鱼的遗传关系图。 2结果分析 2．1形态特征 斜带石斑鱼体具红褐色斑点，体表无不规则白斑，颏部无斑，幽门盲囊43—49。 点带石斑鱼体具黑色小点，体表不规则白斑有或无，颏部有斑，幽门盲囊42-114。 2．2线粒体DNA细胞色素b基因扩增及测序结果 采用本实验室设计的石斑鱼线粒体DNA细胞色素b．(mtDNAcytb)基因特异引物对所16 尾石斑鱼的基因组进行PCR扩增，均获得单一的扩增产物，产物经测序后共得到有效序列 491bp，与其他石斑鱼的同源序列比对发现，斜带石斑鱼和点带石斑鱼中均存在两种不同序 列，即序列A和序列B，其间有18个碱基差异，相似度为94．3％。根据测序及常规形态学 鉴定结果，16尾实验鱼中存在4种类型，即点带石斑鱼序列A、点带石斑鱼序列B、斜带石 斑鱼序列A和斜带石斑鱼序列B。 点带石斑鱼序列A个体体表具黑褐色小斑和不规则白斑，颏部有黑斑较密集，幽门盲囊 多分支，幽门盲囊基部数目114，终端分支263。 点带石斑鱼序列B个体体表具黑褐色小斑，无不规则白斑，颏部有黑斑较稀疏，幽门盲 囊分支少，幽门盲囊数目42。 斜带石斑鱼序列A个体体表具红褐色斑点，体表无不规则白斑，颏部无斑，幽门盲囊分 支较多，幽门盲囊基部数目49，终端分支135。 斜带石斑鱼序列B个体体表具红褐色斑点，体表无不规则白斑，颏部无斑，幽门盲囊数 目分支少，幽门盲囊数目43。 2．3 RAPD结果 对上述4组石斑鱼样品进行RAPD检测，共筛选14个可获得稳定清晰扩增的随机引物 进行统计分析