慢病毒载体法高效率制备双荧光转基因猪的研究.pdfVIP

论文集 慢病毒载体法高效率制备双荧光转基因猪研究 朱志伟，于福先，黄菁，陈晓宇，潘建治‘ 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所动物生物工程研究室，杭州310021 摘要：构建了双荧光慢病毒载体，制备出效价达7．9×109TU／ml的慢病毒颗粒，4pl病毒注射2细胞期猪早期 胚胎，获得3头F0代仔猪，其中l头转基因阳性母猪配种产仔2Hna，共获23头Fl代仔猪，转基因阳性个体占 11头，检测到DsRed与Venus基因的表达。结果表明：利用高效价慢病毒注射早期胚胎，可高效地制备出转 基因猪，外源基因能够稳定遗传和表达。 引言 近年来，我国家畜转基因技术发展迅速，在家畜新品种培育中开始发挥重要的辅助作用。然而细胞核 移植技术成本昂贵、效率较低，对猪而言原核注射法存在原核难以辨认的障碍，因此建立多种猪转基因技 术，根据研究目的加以灵活选用甚为必要。本研究组在探索单精子显微注射法进行猪转基因技术研究的同 时，利用慢病毒能够高效感染多种不同分裂相细胞的特点，快速地制备成功了浙江省第一例转基因猪。 材料方法 克隆红色荧光蛋白(DsRed)基因，构建重组质粒CS 胞，超离和超滤技术相结合浓缩纯化，包装出效价为7．9×109TU／ml的病毒。母猪超排处理收集猪2．cell期的 胚胎，4Dl双荧光慢病毒颗粒注射至胚胎周隙，3气环境下体外培养24h检测荧光阳性胚胎，头均16枚胚胎移 植到同期化的受体输卵管内，受孕、分娩获得仔猪，检测外源基因的后代遗传和表达。 结果 胚胎移植到2头受体猪，怀孕1胎产下F0代仔猪3头。PCR检测后确认其中1头雌性为嵌合完整外源基因 的阳性个体，性成熟后自然交配2JJn’次均成功受孕，共产下Fl代仔猪23头，PCR检测后确认其中ll头为阳性 组织制作冷冻切片，荧光显微镜下与非转基因猪的组织切片对比观察，阳性个体切片均呈现双荧光阳性。 M 1 2 3 4 S 6 7 8 9 1011121314 DSRed p—actin 图1．F0代仔猪RT-PCR电泳图 f1．1l依次为心、肝、脾、肺A、肺B、肾、腿肌、皮肤、卵巢、大脑、小脑：12、13为阴性对照：14为阳性质粒对照) 讨论 利用慢病毒已经在小鼠、大鼠、猴、鸡、猪、牛以及羊上成功导入了外源基因，但受到慢病毒制备质 量、胚胎转染处理方法等因素的影响，慢病毒的高效转基因特点往往难以体现。本研究通过慢病毒制备技 术的优化，包装出效价高达109的慢病毒颗粒，选择体内回收的2一cell期胚胎进行注射，实现了阳性胚胎率 达97％的高效转染。仅仅移植2胎就获得了原代转基因猪个体，繁殖出的F1代中阳性个体比例高达47．8％， 并实现了一次性转化2个基因进行共表达的目标。该转基因程序使用试验猪的数量少，获得的转基因个体 效率高、成本低，外源基因能稳定遗传和表达，可应用于基因功效验证等目的的猪转基因研究。本研究结 果也对其它畜禽的慢病毒载体法转基因具有参考和借鉴意义。 致谢 本研究由浙江省科技项目(2010C12006)和国家自然科学基金项目资助。 +通讯作者：潘建治，研究员，主要从事动物基因工程研究。E—mail：izpan9@126．corn l36