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ELISA影响因素及对策 河北医科大学第二医院检验科 李伟皓 简 介 • 1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷 兰学者Van Sch rs 分别报道以酶作为标记 物的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸 附试验。 • 1974年Voller 等在 《世界卫生组织公报》上 发表了ELISA方法检测血清中疟疾抗体的报 告，展示了ELISA在医学检验中广阔的应用 前景。 • 1978年在上海和北京ELISA讲习班。， Voller 作了专题报告。促进了国内开展 ELISA的研究和应用。 • 1983年 《用ELISA检测乙型肝炎标志物》 的 发表 ，推动了国产ELISA试剂的大规模生产 和广泛的临床应用。 • ELISA 由于测定灵敏、特异和操作简便等诸 多优点，如试剂易于保存、结果判断较为 客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、 最普遍的试验诊断方法。广 泛用于各类医 学实验室。 • 多种感染性疾病的抗原和抗体、自身抗体、 肿瘤标志物、心血管疾病标志物、过敏原 等。 ELISA的原理 • 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载 体上，并保持其免疫活性。 • 测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按 不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗 原发生反应。 ELISA的原理 • 用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复 合物和游离成分。 • 然后加入酶的作用底物催化显色，根据颜 色做定性或定量分析，得出检测结果 • ELISA 法步骤包括标本的加样、温育、洗板、 显色、比色以及结果判断 • 虽然操作简单，但还是需要注意一些因素 的影响，试剂的选择、正确的操作、优良 的仪器都与检测结果密切相关。 ELISA的类型 酶联免疫吸附试验的主要技术类型有 夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。 双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP 、hCG等。只要获得针对受 检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备 酶结合物而建立此法。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合 ，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 2） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶 标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上 带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 3） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过 比色，测知标本中抗原的量。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位 点夹心。 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进 行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间 接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗 体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定， 因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的 制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方 法。 间接法测抗体 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的 诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 操作步骤如下： 1）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体 与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤 后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成 份在洗涤过程中被洗去。 2）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但 一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物 中的抗体与酶标抗体结合，间接地标记上酶。洗涤后 ，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 3）加底物显色 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足 够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 包被物