新型细胞Ca-%272%2b-荧光探针的设计合成的研究.pdfVIP

新型细胞Ca2+荧光探针的设计合成研究 王永祥 摘要细胞内游离Ca2+作为细胞内的第二信使，在生物体中具有非常重要的作 用，其作用几乎涉及到细胞的所有生理生化过程，如：细胞的胞吐、胞饮、神经 递质释放、DNA合成、细胞分裂，乃至细胞的死亡等，因此，细胞游离钙含量及 其时空分布和动态变化的研究已成为化学、生物学和医学研究中的一个非常重要 的领域，也是现代分析化学重要的前沿研究热点之一。 R 自1982年，美籍华裔科学家、加利福尼亚大学的TsienY等合成了第一代 Ca2+荧光指示剂(也称Ca2+荧光探针)，据此而建立的Ca2+荧光探针法由于探针能 在生理条件下快速、灵敏而高选择性的响应胞内Ca2+的瞬变，且其AM酯型可无 损伤导入细胞，同时可采用先进的荧光显微成像分析技术，从而使测定活细胞内 Ca2+浓度的方法取得了突破性的进展。其后该小组又设计并合成出了第二代和第 三代Ca2+荧光探针。目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的 光探针法详细、系统地研究了Ca2+在生物体中发挥的重要作用，初步探明了其发 挥第二信使作用的机制，为进一步了解生命现象做出了重要的贡献。但由于上述 身荧光干扰及光损伤严重；或与Ca2+结合前后荧光峰无位移(如Fluo．3)，采用双 波长比率法进行测定较为困难；特别是上述探针均不具有靶向性，难以进行亚纽 胞区域Ca2+的测定。这些探针自身存在的、无法克服的缺点和不足，使细胞游离 Ca2+含量及其时空分布动态变化的研究方面仍存在一定的困难和障碍，故设计并 合成新型整体性能优良的Ca2+荧光探针仍然是广大试剂合成工作者追求的目标。 本论文试图设计合成一种靶向性、长波激发的近红外新型细胞Ca2+荧光探 针，并就此方面进行了一些有意义的探索和尝试。 本研究论文包括以下三个部分： 一．细胞内游离Ca2+荧光探针研究进展(综述) 对目前常用的几种细胞钙荧光探针，特别针对钙荧光探针的合成研究及其性 能和测定方法进行了较为详尽的综述，并在此基础上提出了拟进行的研究目标。 二．新型细胞Ca2+荧光探针的合成研究 根据所确定的研究目标，设计了新型钙荧光探针的合成路线。实验中我们成 功合成了一种Ca2+荧光探针制备过程中的十分重要的的中间体 等手段对产物进行了结构分析和表征，并与文献资料进行了对比和分析，证明了 反应过程的可行性和正确性，同时也为合成其它相同类型的荧光探针积累了一定 的经验。 三．Ca2+螯合物BAPTA／t-Bu的合成研究 设计合成Ca2+荧光探针的的关键步骤是根据探针分子、荧光发色团和酯的 稳定性条件确定选用BAPTA的哪一种酯型来水解制各其游离酸。在第二章中，我 们设计的新型Ca2+荧光探针合成路线中选用乙基酯型BAPrA(BAPTA／Etester) 来水解制备探针分子的游离酸型，但实验证明在此水解条件下要么整个探针分子 不稳定，要么荧光发色团不稳定，导致我们目标探针分子合成的失败(此部分内 容本论文未予报道)，故我们重新设计并成功合成了Ca2+荧光探针合成过程中的 另一重要中间体叔丁酯型BAPTA(BAFFA／t．Buester)。并利用元素分析、红外光 谱(FT—IR)和核磁共振(1HNMR)等手段对产物进行了结构分析和表征，证明了 反应过程的可行性和正确性，同时也为合成其它相同类型的荧光探针积累了一定 的经验。 关键词：细胞内游离Ca2+；Ca2+荧光探针；Ca2+荧光指示剂；合成 n