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青霉素结合蛋白测定技术 　　【关键词】氘标记青霉素结合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳荧光放射自显影 　　【摘要】当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对β-内酰胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(PBPs)改变造成的耐药性,是β-内酰胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs 　　当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对卜内酞胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(PBps)改变造成的耐药性,是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质,是细菌致死的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱,以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以,PBPs测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段[l]。的穿透力弱,用一般放射自显影法不能获得PBPs图谱,需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关PBps测定技术报道甚少,以3H标记者更少,本文介绍这一技术。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌种肺炎链球菌31003,30301(北京药品生物制品检定所;Pen08.R6本室保存菌种。 　　1.1.2培养基C+Y培养基,参见文献(2)。 　　1.1.3仅器及药品 　　垂直板凝胶电泳槽(吴县科研仪器厂);NG一l型真空凝胶干燥器(太仓电视机厂);TGLL一1a型台式高速冷冻离心机(中科院上海生物化学研究所);8438一超低温冰箱(FormaSclentifi。,美国);电泳仪DY一1型(上海医用分析仪器厂);丙烯酞胺(Aerylamide,临海止学厂产);甲撑双丙烯酞胺.(big;瑞士产品);N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED,上海前进农场制剂厂);3H标记青霉素乙酞呱陡盐(NewEngiandNuclear,美国);x光底片(天津感光材料厂;KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em);2,5一二苯基嗯哇(PPO,闪烁纯,上海试剂一厂);月桂酞肌氨酸钠(Sarkosyl,Sigma);十二烷基硫酸钠(SDs,上海新华化工厂);二甲基亚矾(DMso,北京旭东化工厂)。 　　1.2方法 　　1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养,次日再移种新鲜培养基中,37℃培养2~3h至对数生长期,菌数约为个/ml(CFU/ml),菌液分装试管,每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000:/minlom仇,弃去上清,菌体沉淀用50以磷酸缓冲液(PH6.8)做成菌悬液,然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保温10min使细胞溶解,加入30协一样品缓冲液,煮沸3min,置室温备用。 　　1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚0.2cm),凝胶配方:分离胶(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/l)5ml,10%SDS0.2ml,蒸馏水8.1ml,真空搅拌10一15min除去气体,再加入TEMED,浓缩胶(5%):按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。先配制分离胶,灌注直立式电泳槽后,使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶,放入加样梳,静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流,第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3一4h,用考马斯蓝R250染色30一45min,过夜脱色。 　　1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(DMSo)处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n,20%即。处理2一3h,l%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上,使用凝胶真空干燥器进行真空干燥,将凝胶片和x光底片贴紧,置于x光射线暗匣内,放超低温冰箱一70℃使曝光1~Zwr,将x光底片显影,定影,冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件:(1)国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片,加6层红色玻璃纸滤过,x光底片上覆盖6层红色玻璃纸,距离50cm,闪光灯闪二次;(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV,距离40em,每张x光底片曝光0.04s。 　　1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃10min,然后加入饱和量的氛标记青霉素,37℃保温10min,再按上述方法继续进行实验。 　　2结果与讨论 　　本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量,首先需要分离菌体蛋白,为