山梨糖脱氢酶的表达纯化和酶学性质研究.pdfVIP

山梨糖脱氢酶的表达纯化及酶学性质研究 张惟材。汪建华 王虹 北京生物工程研究所，北京100071 山梨糖脱氢酶是存在于普通生酮基古龙酸菌中负责维生素C两步发酵中山梨糖 生物氧化的一种醌酶。本文采用pQE60在大肠杆菌对该酶进行了高效表达，通 过离子交换和亲和层析的方法从工程菌细胞裂解物中纯化得到了山梨糖脱氢 酶，并对该酶的酶学性质进行了研究。该酶的分子量约为60kD，最适反应pH 值为8．0，最适反应温度为31℃。该酶的底物范围较广，多种醇、醛类化合物 可作为该酶的底物，该酶以L．山梨糖和正丙醇为底物时米氏常数分别为21．9和 用。 山梨糖脱氢酶基因的克隆 30 30 s，30个循环后72℃ 扩增条件为：94℃5min变性进入循环：94CS，60CS，72℃90 继续延伸5min。通过O．8％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。得到的PCR产物在琼脂糖凝 胶电泳胶上呈单一特异性条带，大小与预期扩增片段(1838bp)相符，扩增产物正确。 pQE60-sdhHis表达载体的鉴定 以PCR方法进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示采用引物P1和P2扩增出的特异性片段， 大小与预期产物大小(1838bp)相符，表明所检测重组子中均含有外源目的片段。选取其 kb和3．3kb的电泳 中1个重组子，提取质粒用Nco，和列口双酶切鉴定，出现约为1．8 带，与预期结果相符，表明重组质粒构建正确。 山梨糖脱氢酶基因表达的SDS．PAGE检测 将JMl09／pQE60．sdhHis菌株37C、200 终浓度为lmmol／L，37C、200r／min继续培养5h，离心，收集菌体SDS—PAGE电泳分析， 电泳显示在分子量约为60kD处有一特异表达带，与预测的山梨糖脱氢酶分子量相符。 山梨糖脱氢酶基因表达的活性检测 以小菌破菌液为阳性对照，JMl09／pQE60破菌液为阴性对照，电泳显示阳性克隆在山梨糖 脱氢酶位置出现活性条带，表明sdh基因连入pQE60载体，且表达产物具有山梨糖脱氢酶 活性。 基金项目：国家自然科学基金资助项目 1 0 通讯作者：张惟材，E—mail：zhangweicai@hotmail．com，Tel．0 167 山梨糖脱氢酶的纯化 山梨糖脱氢酶经过DEAE Fast SepharoseFlow分离纯化、QSepharoseHigll Performance分离纯化以及Ni2+金属螯合层析分离纯化，经三步纯化后酶的比活力提高， 通过SDS．PAGE凝胶电泳分析，该酶蛋白为一条带，分子量约为60kD。 山梨糖脱氢酶的酶学性质研究 对山梨糖脱氢酶的底物作用范围进行考察，该酶的底物范围广泛，多种醇、醛、 可为其底物，选择山梨糖和正丙醇为底物测定Km值。 不同底物的Km值，由以下结果可以得出，山梨糖脱氢酶对正丙醇的亲合力大于山梨糖。 以山梨糖为底物肘K。值为21。9mmol／L；以正丙醇为底物时K。值为0．13mmol／L。 山梨糖脱氢酶反应温度：经测定，山梨糖脱氢酶的最适反应温度为31℃。 山梨糖脱氢酶反应pH值：山梨糖脱氢酶的最适反应pH值为8．0。当pH值小于5．5时， 该酶的活性急剧下降，在pH为8．0时，酶活达到最大。 酶的稳定性：经测定山梨糖脱氢酶在lO℃、25℃时稳定，而在55℃、65℃时迅速失活。 不同浓度金属离子对该酶的激活与抑制：将不同浓度的金属离子加入酶反应液中，观察 其对酶活性的影响。观察到Ca2+对山梨糖脱氢酶有极大的激活作用，而微量的C02+、Cu2+ 对该酶有强烈抑制作用。 讨论：普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)的糖酸转化系由一种以吡咯喹啉醌(PQQ)为 辅酶的脱氢酶催化完成，本室首次分离得到该酶的基因，将其命名为山梨糖脱氢酶基因 1ml镍柱对该