用β-Casein初探AXIMA-CFR+plus型MALDI-TOF质谱仪在蛋白质磷酸化研究中地应用.pdfVIP

第24卷增刊 分析测试学报 V01．24 FENXICESHI 2005年11月 XUEBAO(JournalofInstrumental NOV．2005 Analysis) MA—CFR 用卢-Casein初探AXI TOF质谱仪在蛋白质磷酸化研究中的应用 钟丽君1，万乐人2，林继红2，彭嘉柔1 (1．北京大学医学部医药卫生分析中心，北京100083；2．岛津公司，北京100020) 众多蛋白质翻译后修饰(PTM，post—transcriptional 化是最常见、最重要的一种蛋白质共价修饰方式。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的 所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。尤其在细 胞应答外界刺激时，蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号传递方式之一。对蛋白质磷酸化修 饰的研究是蛋白质结构分析与鉴定中一个非常重要的内容，确定蛋白质磷酸化修饰位点并总结其相 关的序列特点有助于对其功能的进一步了解。生物体内，能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白 物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸¨J。 质谱(MS)已经在蛋白质组研究中成为揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一 个不可缺少的工具，本实验使用AXIMA—CFRplus生物质谱仪，分析磷酸化标准蛋白口．Casein的磷 酸化多肽，为蛋白质的翻译后修饰寻找更便捷的研究方法。AXIMA—CFRplus质谱仪配有曲面反射 field 器(curvedreflectron)，该仪器专利的曲线场技术，提供更大的质量范围扫描，在做源后裂解 source (post decay，PSD)的时候，一次激光照射就可以得到所有碎片信息，可进行全自动母离子选 择和碎片采集，以及数据库检索。并且在碎片离子的采集过程中，母离子始终可见，保证了碎片离 子和母离子的亲缘关系。而使用其他类似质谱仪则需分别选择目标离子，一次仅产生一张碎片谱 图，再多次重复离子选择步骤，得到所有谱图，之后软件拼接这些图谱，结果不是一张真正的谱 图，故得到的信息不完整。因此利用该仪器的这种技术，用源后裂解(PSD)功能快速准确测定肽段 中磷酸化位点的数目，有助于进一步研究蛋白质的磷酸化位点。 1 实验部分 1．1 实验材料 chain lI，ACTH18—39和insulin (DHB)angiotensin 1．2 实验仪器 extraction 津公司)上采集，该质谱仪配有脉冲提取离子源(pulsed source)，专利的曲面反射场 field (curvedreflectron)，N，激光器，激光波长337nm，加速电压为20kV，实验样品点在微量级 1 384样品靶板。仪器校正采用3种标准蛋白：angiotensinlI(m／z046．5)，ACTH18—39(m／z 2 chain 3 465．2)，和insulinB(m／z494．7)的混合物进行三点校正。质谱信号为单次扫描累加，以 反射模式正离子谱测定。 1．3样品及基质配制 mL50mmol／L 取牛口．酪蛋白1mg，加1 牛beta酪蛋白，加100ng胰酶，37℃保温反应4 20 0．1％TFA(1：1)的混合液制成饱和溶液。基质DHB 中。 1．4实验方法 IxL此溶液滴于样品靶板上，室温干燥，使样品与基质在 吸取1肛L样品和1斗L基质混匀，取1