猪、野生动物源大肠杆菌、沙门氏菌对磺胺类药物耐药基因检测的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜生态学分会2006年学术会议论文集 179 猪、野生动物源大肠杆菌、沙门氏菌对磺胺类药物耐药基因检 测研究 周万蓉1王红宁2·3张安云1吴琦2黄勇2柳萍2田浪2杨鑫2刘立2夏青青2 (1四川农业大学资源与环境学院，雅安四川625014；2四川农业大学动物科技学院，雅安四 【摘要】本研究对从四川地区10个规模化猪场和16种野生动物(长颈鹿、金丝猴、黄虎等)的粪样 中分离鉴定出的67株大肠杆茵、57株沙门氏菌，应用K-B法进行药敏实验．结果表明，猪源大肠 杆菌，沙门氏菌对磺胺类药物的耐药率分别为70．0％和74．0％；野生动物源大肠杆菌、沙门氏菌对 基因同时存在的菌株。药敏试验结果与基因检测结果符合率为89．9％． 【关键词】猪； 野生动物； 大肠杆菌； 沙门氏茵； 磺胺类药物； 耐药性检测 磺胺类药物由于价格低，易于保存和储存，抗菌谱广，药效显著等优点，已在养殖业中作为兽 药应用了70多年，但是同时细菌对其也已经产生了广泛的耐药性【l】。国内外研究表明，临床上的革 兰氏阴性肠道菌对磺胺类药物的抗性很大程度是经质粒介导的，主要是由于出现替代性对磺胺类药 物亲和力更低的新二氢叶酸合成酶，即有抗性的DHPSt2]。而在革兰氏阴性肠道菌中，目前的研究 共有三种具有对磺胺类药物抗性的二氢叶酸合成酶，其基因分别命名为Sull、Sul2、Sul3。因而对 这三个耐药基因的检测就能够从分子水平上反映出细菌对磺胺类药物的耐药性【3】。 本研究对四川地区规模化猪场和生活环境相对特殊的野生动物分离菌对磺胺类药物的耐药情况 进行表型及分子水平的调查。以了解这些分离菌对磺胺类药物的耐药情况，耐药基因的分布情况， 以期为细菌耐药性及其耐药基因研究提供更广泛而深入的资料。 1实验材料 1．1供试菌株 1．1．1四川地区规模化养殖场猪源沙门氏菌50株，大肠杆菌50株。四川碧峰峡16种野生动物源(长 颈鹿、黄鹿、自屠鹿、梅花鹿、金丝猴、蜂猴、小白虎、黄虎、海狮、白狮、狮子、大象、袋鼠、 因的阳性对照株：大肠杆菌MSPE020218分离株(已测序检测鉴定)。 1．1．2药敏标准菌株药敏质控菌ATCC25922(购自卫生部药品生物制品鉴定所) 以上菌株由四川农业大学动物预防医学与生物工程实验室保存。 1．1．3培养基及试剂 培养基：营养琼脂、三糖铁琼脂、S．S琼脂、麦康凯琼脂，亚硒酸盐胱胺酸增菌培养基(SC培 养基)，LB液体培养基和M．H琼脂 Marker、 试剂：TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2购于博瑞克(成都)有限公司，DL．2000 中国畜牧兽医学会家畜生态学分会2006年学术会议论文集 DNAMarker 司。 1．1．4供试药物 磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、复方新诺明(SMZ-TMP)(购于杭州微生物制剂所) 2实验方法 2．1K．B法药敏实验 参考[41进行，以NCCLS2005为评判标准。 2．2pCR检测 2．2．1引物设计 根据Genbank上提供的Sul基因序列， 在sull，sul2，sul3基因特异性较高的区域分别设计三对 PCR引物，经特异性分析三对引物与大肠杆菌和沙门氏菌全基因组中的其它基因没有同源率，或同 源率很低，并委托上海生工有限公司合成，引物序列情况见表1。 表1 三重pCR引物设计结果 2．2．2三重PCR扩增 参照文献【6】，加以改进后制作PCR反应模板。本实验先确定各单重PCR的参数允许范围，再在 各单重PCR的公共范围内寻找多重PCR扩增条件，并进一步优化，建立了三重PCR方法。反应条 伸10min，于低温4℃对PCR产物进行保护。 2．2．3PCR产物检测 DNA染 采用常规琼脂糖凝胶电泳法进行电泳。琼脂糖凝胶浓度为2％，含0．001％的Gold-view 料，缓冲液为lXTAE，以80V恒压电泳40min后置紫外凝胶成相系统下照相并保存。