重组HBcAg和HBsAg联合疫苗的免疫效果研究.pdfVIP

重组HBcAg与HBsAg联合疫苗的免疫效果研究 姚伟1，刘广洋2，任雅平’，李玉1，张岩锐1，任魁1，沈心亮3 【摘要】 定抗体滴度；制备脾脏单个核细胞(MNC)，ELISA法检测细胞因子分泌水平；应用流式细胞仪分析T细 胞亚群。 结 论重组HBcAg-与HBsAg联合制备的疫苗，表现出良好的体液免疫与细胞免疫效果，对于以此为基础的 治疗性乙肝疫苗的开发提供了一定的试验基础。 【关键词】重组HBcAg；重组HBsAg；免疫；细胞因子；T细胞亚群 慢性乙型肝炎之所以难治是由于患者体内的免疫细胞处于“睡眠”状态。研究发现乙肝病毒持续感 染形成的感染慢性化，主要是病毒诱导宿主对其感染形成的一种持续的免疫耐受状态，特别是CTL的 低应答状态，如能打破免疫耐受，激发机体对病毒的特异性免疫反应，则可能清除病毒，使感染所造成 的损失得以恢复”1。近年来由于基因重组技术的发展及免疫学理论和技术的新进展等使得利用疫苗来治 疗慢性乙肝成为研究的热点。尤其是细胞免疫在疫苗免疫应答机制中的作用受到人们的重视。国外已有 良好清除作用的治疗性疫苗。 1．材料与方法 1．材料 1．1样品 原液(批号20050327，浓度：97．5gg／m1)，由本室制备。 1．2试剂 Con 1640培养基：含10mmol／L A，LPS购自Sigma公司；淋巴细胞分离液购自Cedarlane公司。RPMI (北京100024) 1—834031 1-6242 通讯作者：姚伟，E-mail：lzhyw@sohu．com；Tel：093 —888～ HEPES、2mmol／LL一谷氨酰胺、lmmol／L丙酮酸钠和5×10。mol／L 2一巯基乙醇、胎牛血清由本所提供。 anti—mouseCD3、FITCanti～humanCD4、PEanti—human 流式细胞术抗体PE—Cy5 CD8购自联科生物，为 3．08％)，本室自行配制。 eBioscience公司产品。M(OH)3溶液(4tt号含AI(OH)313．31mg／ml，NaCl l_3动物 无特定病原体健康BALB／C／J,鼠，雌性，8～lo周龄，出生后从未接触过HBsAg，本所实验动物室提供。 2．方法 2．1抗原的配制 ③不含Al(0H)，佐剂的10肚∥nllHBsAg组；④不含Al(0H)，佐剂的10pg／mlHBcAg+HBsAgI联合免疫组(以下 2．2动物免疫 用上述抗原分别腹腔免疫BALB／C／],鼠，每只小鼠免疫0．5ml，每两周免疫一次，共免疫3针，初次免 疫后第6周采血，无菌取脾脏，培养脾细胞。 2．3抗体检测 免疫结束后采血，用ELISA法N／J鼠表面抗体。 2．4细胞因子的测定 免疫结束后常规无菌制备脾细胞悬液并经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC)，用完全培养基 5％CO：条件下培养72h，收集上清。用小鼠IFN一1，ELISA试剂盒检测细胞因子。 2．5淋巴细胞亚群分析 免疫结束后常规制备脾悬液并经淋E2ftt胞分离液分离出单个核细胞(MNC)，用完全培养基(含15％胎 牛血清的RPMll640培养液)调整细胞浓度N106／ml，分别取Jml细胞，4000dmin离一L,2min，以细胞洗液 anti—mouse 洗涤1次，去除大部分上清，留下10pl液体，轻弹将细胞悬起，分别加人PE—Cy5CD3、FITC anti—humanCD4、PEanti—human 离心后细胞重悬于适当体积细胞固定液中，流式细胞分析仪分析T淋巴细胞亚群。 2．6统计学分析 应用SPSS统计