转GO基因棉花体内葡萄糖氧化酶的表达和其抗病性研究.pdfVIP

植物保护与现代农业 转GO基因棉花体内葡萄糖氧化 酶的表达及其抗病性研究+ 刘慧君 赵磊 简桂良” (中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094) 摘要：通过对转GO基因棉花品系B99267．1、B99261及其受体新陆早7号和非转基因棉 花品种中棉所12号葡萄糖氧化酶的时空表迭及其对棉花黄萎病抗性的比较研究。结果表明：在 初花期、花铃期和吐絮期三个棉花生育期中，初花期酶活水平较低，吐絮期最高；各生育期下 部和中部叶片酶活普遍高于顶部叶片酶活。棉花叶片组织中GO活性、GO蛋白含量和内源 H：O：含量均成正相关，酶活高的叶片GO蛋白含量高、心O：含量也高。转GO基因棉花品系 B99267-l和B99261对比感病受体新陆早7号，表现出明显的抗黄萎病性能，达到高抗水平。 关键词：转GO基因棉花；黄萎病抗性；葡萄糖氧化酶 近年来，通过基因工程技术将有关的抗病虫基因导入农作物中，以改变农作物的抗病 虫性，已成为农业基因工程的主要内容之一。棉花作为最成功的转基因作物，目前已将杀 虫、抗病、抗除草剂基因成功地转人其中。近年来，我们与其他单位合作，将一些与抗病 性有关的基因，如几丁质酶基因(Chi)、葡萄糖氧化酶基因等导人到抗虫棉品种中，以 改变抗虫棉的抗病性，并已选出一些阳性株系∞J，但导入这些抗病基因后，这些基因在 棉花中的表达水平如何，在棉花不同生育期，不同部位时空表达水平怎样，则有待研究。 为此，我们开展了两年比较研究，以明确导入外源基因后对棉花的影响。为未来植物基因 工程的开展提供参考。 1 材料和方法 1．1 材料 株系。 1．2葡萄糖氧化酶蛋白含量测定 棉花花铃期取各挂牌单株不同部位叶片，用酶联免疫法测定植株中葡萄糖氧化酶蛋白 含量。葡萄糖氧化酶一抗由中国农业科学院生物技术研究中心王志兴先生提供，碱磷酶标 二抗购自华绿渊生物公司： ·项目资助：自然科学基金资助项目资助 作者简介：刘慧君(1974一)，女，湖南岳阳人，硕士，研究方向为植物病害 ¨通讯作者：简桂良，E·mail：幽ian@ippcaaa．C11 研究论文 135 1．3大田植株葡萄糖氧化酶活性测定 在棉花初花期、花铃期和吐絮期，从田间挂牌植株上部、中部和下部植物叶片，测定 各棉花品种在不同生育期不同部位叶片组织酶活含量。上部叶片为植株顶端幼嫩叶片、下 部叶片取植株最下面果枝上靠近主茎的第一片真叶，中部叶片取上部和下部叶片中间果枝 上靠近主茎的第一片真叶。 葡萄糖氧化酶活性测定所依据原理为：葡萄糖+0：j堕壁坚葡萄糖酸+H20：。pH 活的测定主要是H，0：含量测定。过氧化氢在过氧化物酶的作用下可产生氧自由基，氧自由 基与邻联甲苯胺作用生成蓝色物质，与苯酚和4．氨基安替比林反应生成红色的醌亚胺，均可 用来测定H：0：含量。邻联甲苯胺灵敏度高，但不稳定；苯酚产生的醌亚胺稳定但灵敏度不 高，需要采用一种灵敏度高且能稳定存在的色原剂。为此，H：O：测定方法采用崔云龙等合 龙等，1992)。本试验中所采用的TBHBA由武警总医院崔云龙主任惠赠。 2 结果与分析 2．1 棉花成株期不同生育期叶片酶活比较 分别在棉花初花期、花铃期和吐絮期取田间所有挂牌棉株不同部位(上、中、下) 检测到葡萄糖氧化酶活性，表明单株中没有导人葡萄糖氧化酶基因。非转基因对照品种早 7和中12中也未检测到葡萄糖氧化酶活性，说明常规棉体内不存在葡萄糖氧化酶(贾士 到葡萄糖氧化酶活性，且植株不同生育期、不同部位叶片组织中酶活水平不同。 从植株不同部位叶片组织来看，各转基因品系不同生育期葡萄糖氧化酶酶活性高低均 呈：下部叶片中部叶片上部叶片趋势(图3)，且花铃期和吐絮期下部叶片酶活均显 著高于上部叶片，但初花期不同部位叶片内酶活水平差异不显著(表1)。 表1棉花不同部位叶片GO酶活比较(umts／g蛋白) 测定各转基因品系不同生育期棉花叶片组织中葡萄糖氧化酶酶活性变化，从图3可看 出，吐絮期酶活水平最高，初花期最低，花铃期居中。将不同生育期酶活进行方差分析， 136