一株丙烯腈降解菌的筛选、鉴定和培养研究.pdfVIP

一株丙烯腈降解菌的筛选、 鉴定及培养研究 王敏 钟莉萍 张锦丽 丁文杰 天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院 【摘要】以葡萄糖为碳源，逐步增大培养基中丙烯腈浓度重复续代培养，从土样中筛选到一株腈水 rDNA序列比对分析确定菌株ZH8属于剧幻比优蝴，序列号 合酶活力较高的菌株ZH8。经形态观察和16S 10一moIA_，280C培养72h，腈水合酶活力达892．46U／mL，与优化前相比提高了108％。 【关键词】丙烯腈；腈水合酶；丙烯酰胺；红球菌 腈是一类重要化合物，其水解反应广泛应用于 使用Ⅲ。目前已知运用于生产丙烯酰胺的微生物有 氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。自然界中 一些微生物能利用腈作为生长所必需的碳源和氮 源，将腈转化为其他有机物。与化学水解法相比， (Corynebac 生物转化法具有条件温和，环境污染小，无副产物， 产碱杆菌(A]calYgenes)、短杆菌 腈转化率高达100％等优点，并能实现化学选择、区 域选择和对映选择。生物转化法涉及的酶主要有腈 相当广泛。本文主要叙述了丙烯腈水合酶产生菌的 水合酶、腈水解酶和酰胺酶。这些酶通常为胞内酶。 筛选、鉴定及培养条件。 腈或酰胺作为唯一碳、氮源或作为诱导物时，可形 1、材料与方法 成诱导性的腈水合(解)酶或酰胺酶。 1．1、实验材料 丙烯腈能通过生物转化法生成丙烯酰胺。丙烯 土样：从丙烯酰胺生产厂附近采集土样。 酰胺是一种重要的有机化工原料，以其单体合成的 丙烯腈、丙烯酰胺、乙酰胺，以上试剂均为分 产品不下百种，其中聚丙烯酰胺用途最为广泛，在 析纯。 采油、水处理、地质、冶金及造纸等行业中被广泛 1．2、实验仪器 ·614· 2007年全国发酵行韭高峰论坛 }|￥G～Il a型逛转式恒温诿速摇瓶挺；S溅喝型水 辫攀蔼落舞室，一般免3--．4d。挑取长势好翡攀 浴恒温振荡器；UVmini-1240型紫外可见分光光度菌落转接于斜筒培养基，谶于生化培养箱中30℃ 计；GC7890II型气糖色谱仪。 培养3．4d。 i，3、培养基 2．1。2、丙烯腈转讫能力的测定 斜面培养基(g／L)：牛肉脊5，蛋白胨l，NaCl2．1．2。l、转化实验 鑫，骧膳2，蝉7．2。 从莲体斜嚣上接替予装有30ml富集培葬綦 0。5， 富集培养基(g／L)：葡萄糖5，l(}|∽04 (培养基灭菌后加入0．3％丙烯腈)的250mi的三 K矗P04 H200．2，NaCll，FeS04·7 0。5，MgS04·7 角瓶中，于180r／min、30℃下港养72h。然嚣向 5X 鹣O lO喵mol／L，CoC王2·6酗5x10晦mol／L， 培养液中添如3％(体积分数)的丙烯腈，每隔一 pH7．0。灭菌后加入丙烯腈。 定时间取样测丙烯腈转化攀。 分离壤养基(g压)；牛离膏5，蛋鸯艨差，NaCI 2。董．2。3、捡涎方法嘲 5，琼脂2，pH 7．2。灭菌后加入3％的丙烯腈。 气相色谱(Gc)分析法。气相色谱条件：气 种子培莽基(g屈)：甘油lO，蛋白艨鑫，麦 相色谱便为TECHCOMPGC7890II，不锈钢填充桂， 芽汁3，酵母浸粉3，球7．0。 填料为PorapakQ，长