正北芪中一种活性糖蛋白的分离纯化和理化性质研究.pdfVIP

中医药生物化学与分子生物学通讯 正北芪中一种活性糖蛋白的分离纯化及理化·l生质研究 张俊英1’2薛慧清1木冯前进1周然1李敏1严佳佳2 (I．山西中医学院太原0300242．山西振东制药股份有限公司长治047100) 摘要黄芪粉末经缓冲液55℃浸提、离心、透析、冷冻干燥得蛋白质粗品，粗品经QSepharose、 DEAE Sepharose柱层析得到糖蛋自AmGP．3；经Sephacryl 为单一物质；运用毛细管电泳法、质谱法测得其分子量为16．8kDa，等电点为3．9～4．3：苯酚．硫 酸法测定糖蛋白纯品的糖含量为23．7％；BCA法测定蛋白含量为66．O％。肛消除反应证明糖与蛋 白以Q糖肽键连接；LTQ-MS鉴定N端氨基酸序列为ESGINLQDATL。 关键词黄芪；糖蛋白；分离纯化 药，具膂‘补气升阳，益固表卫，利水消肿，托疮生肌之功效IIJ-免疫调节是黄芪的主要药理活 性，目前研究较多的是对机体的免疫增强作用，药效成分主要为黄芪多糖田。本课题组多年来致 力于黄芪中蛋白类生物大分子的研究，首次从中分离得到一种分子量约为5326kDa的糖蛋白 HQGP【3J，体内、体外实验证明其具有明显的免疫抑制作用㈣。本文在前期研究基础上改进了分 离纯化方法，从产自山西浑源的道地药材一正北芪中得到了一种新的活性糖蛋白，并对其分子量、 等电点、红外光谱、糖肽键类型、蛋白质及糖的含量、氨基酸序列等进行了分析。 1材料与方法 1．1材料 黄芪，采自山西省浑源县正北芪种植基地．经山西中医学院裴香萍副教授鉴定为蒙古黄苠的 干燥根；透析袋(截留分子量3500solarbio公司)；标准分子量蛋白由Th靓inoscientific提供；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(博士德生物)：Q S．100(瑞典Pharmacia Sepharose、DEAESepharose、Sephaeryl 公司)。 细管电泳仪(美国)；Eksigent液相-LTQ-MS质谱仪。 1．2糖蛋白的分离纯化 1．2．1提取：称取黄芪粉末1009，以lO倍量Tris缓冲液：TrisHCl(25mM pH8．0)-NaCI(50mM) 溶解，55C浸提lh，纱布过滤，滤渣再以8倍量Tris缓冲液浸提lh后，纱布过滤，合并第一次 滤液；离心取上清液，透析，冷冻干燥得粗蛋白质粗品。 1．2．2分离纯化：蛋白质粗品采用AKTA avant25蛋白纯化系统，经过阴离子交换柱；Q 圆硷顾目】 省科技攻关计划项目(20130321031-01)：山西省自然基金项目(2009011013．1) [作者简介】张俊英，硕士，中药生物大分子研究 陋讯作匍 物活性成分研究 140 中国生化学会中医药生化分会年会 北京．2013 17ml(Cv)，上样量：10ml，上样后以bu腩rA：嘣sCl(25raM Sepharose pH8．O)-NaCI(50mM) 平衡5CV，以梯度洗脱：0--15％butlerB，5CV；15％--50％bufferB，5CV；50*／旷100％bufferB， 5CV：bufferB：TrisCl(25mM 集样品组分峰：再经过DEAE 44ml(CV)以相同洗脱方式洗脱，收集组分峰，水中透 Sepharose 析后冷冻干燥，得到白色片状固体黄芪糖蛋白AmGP-3。 l·3 AmGP．3纯度鉴定 1·3·1葡聚糖凝胶层析：将糖蛋白纯品少许溶解在50mM 中，在16／60Scphacryl 1*3,2SDS．PAGE电泳 分离胶浓度12．5％，浓缩胶浓度5％，起始电压80V，溴酚蓝前缘进入分离胶后120V，电压 2~3h，考马斯亮蓝R-250染色，采用标准分子量蛋白质做标准。 14