葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响_药学论文.docVIP

葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响_药学论文 葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响_药学论文 作者：李倩，王继红，程梅，王欣，曾建涛 【摘要】 目的：观察高浓度葡萄糖对人肝细胞株（L02）及胰岛素抵抗细胞模型（IR）的血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）表达的影响，探讨ANGPTL3与糖尿病（DM）并发高脂血症的关系，在细胞水平分析DM并发高脂血症的分子机制. 方法：以L02为研究对象，并建立胰岛素抵抗模型（IR）. L02和IR两组细胞分别在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0 mmol/L葡萄糖的培养液中培养，5.6 mmol/L组作为对照组. 用RT方法检测ANGPTL3的mRNA表达量，并用Western Blot方法检测ANGPTL3蛋白质表达水平，分析ANGPTL3与DM并发高脂血症的关系. 结果：高浓度葡萄糖可促进L02和IR两组细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，并呈一定的量效关系，变化差异均有统计学意义（0.0001）；IR细胞对葡萄糖的刺激尤为敏感（0.0001）. 结论：高浓度葡萄糖可上调ANGPTL3的基因和蛋白质表达，其在DM并发高脂血症中可能起重要作用. 【关键词】 血管生成素样蛋白3；糖尿病；高脂血症；葡萄糖；胰岛素抗药性 0引言 人血管生成素样蛋白3（angiopoientin，ANGPTL3）是Mr约为70 ku的分泌蛋白，由460个氨基酸组成，其氨基端的螺旋样结构域与调节脂质代谢的功能相关，主要在肝脏中表达［1］. ANGPTL3可通过抑制脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的活性导致以极低密度脂蛋白（very low，VLDL）三酰甘油升高为主的高脂血症. 脂代谢与糖代谢在多个环节相互作用，共同影响糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发生与发展. 血脂异常是DM的危险因素，而有关ANGPTL3与DM相关性的研究目前国内外都极少报道. 本实验通过研究高糖环境下人肝细胞株（L02）及其胰岛素抵抗细胞模型（insulin resistant L02，IR）ANGPTL3的mRNA和蛋白表达量变化，分析葡萄糖对该基因表达的影响，拟从分子水平探讨ANGPTL3在DM并发高脂血症中的病理生理作用. 1材料和方法 1.1材料L02（重庆医科大学基础研究所）；RPMI 1640培养基，1∶125胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；RTPCR试剂盒（宝生物大连有限公司）；ANGPTL3 基因引物和βActin引物，胰岛素（上海生物工程技术服务有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和βActin小鼠mAb（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎国生物制品公司）；免疫印迹（Western Blot）试剂盒（Santa Cruz公司）. PCR仪，微型电转移装置，GelDoc 100凝胶成像仪（美国BioRad公司）. 1.2方法 1.2.1细胞培养和胰岛素抵抗模型的建立L02细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液在50 mL/L CO2, 37℃条件下培养，选取对数生长期的细胞用于实验. 用含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液培养16 h的L02细胞代替胰岛素抵抗模型，称为IRL02细胞，以在不含胰岛素的培养液中培养16 h的L02细胞为对照. 细胞计数,接种后随机分为L02细胞组和IRL02细胞组. 其中L02细胞组在上述条件培养16 h，更换无血清培养液培养24 h后，又分为G1~G5五个亚组，分别用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L的葡萄糖培养液培养24 h，设G1为对照组. IRL02细胞组：除用含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液替换胎牛血清培养L02细胞外，其它培养条件和时间与L02细胞组完全相同，同样分为IRG1~G5五个亚组，设IRG1为对照组. 1.2.2RTPCR检测ANGPTL3的mRNA表达量按总RNA抽提试剂盒说明操作提取细胞总RNA，用UV法定量分析RNA得率和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性. cDNA合成（10 μL反应体系）：取MgCl2 2 μL，10×RT缓冲液1 μL，无核酸酶蒸馏水3.75 μL，dNTP混合液1 μL，RNA酶抑制剂0.25 μL，AMV逆转录酶0.5 μL，随机引物0.5 μL，总RNA(300 ng) 1 μL. 逆转录反应条件：30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，所得产物用于PCR扩增. PCR反应：采用Primer Premier 5.0软件设计ANGPTL3引物和βActi