荧 光 光 谱(.pdfVIP

生物物理技术综述 荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy) 韩荣成 北京大学,03 级生物医学工程 一、背景知识： 1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸 收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有 红外荧光、X 射线荧光等。 在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。 分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能 （electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。Ee 大 约为 1eV数量级；Ev大约为 10－1～10－2 eV ；Er 大约为 10－4 ～10－5eV数量级， 可见⊿Ee ⊿Ev ⊿Er 分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1 的最低振动能 级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在 10－11s内。从S1 的最低振动能 级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光 （fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭 （quenching）。如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比 1 生物物理技术综述 荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。磷光产生的机制与荧光是不同的， 虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子 直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动 能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的 光。 所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋 方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为 0 的情况。处于第一电 子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线 态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于 三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样， 在三线态停留的时间即寿命就比较长(从 10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能 量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。 二、荧光光谱： 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作 用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效 率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况， 也就是荧光中不同波长的光 成分的相对强度。 激发谱既然是表示某种荧光 物质在不同波长的激发光作 用下所测得的同一波长下荧 光强度的变化，而荧光的产生