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第3讲 荧光光谱 荧光是怎么产生的？有什么用途？ 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪些因素会影响到荧光强度？ 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么用途？ 2.常用荧光光谱 2).荧光光谱的特征 镜像规则的解释 4. 荧光光谱参数 1）荧光光谱参数： （ 2). 荧光各向异性 5. 荧光实验方法及其用途 荧光猝灭 荧光各向异性 荧光能量共振转移 时间分辨荧光光谱 荧光标记 双光子荧光光谱 （1）各向异性的时间相关特性 一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。 如果是球形的样品，将会有单一衰减指数； 大多数情况将会有多个衰减指数。 原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同运动状况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的旋转相关。 如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会改变。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动力学。 能量转移也会影响各向异性衰减。 在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多信息。 5. 荧光标记 有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发荧光，成为内源荧光。 如染料与与研究对象结合，作为探针应用荧光方法与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。 加入染料不应影响大分子的结构 加入染料不应影响大分子的功能 标在不同位置，效果不同。 标记方法： 1）有转基因标记： 单点转基因标记: 把某个氨基酸改变成Trp,或者转变成Cys再与荧光探针结合。 荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白，GFP, YFP, 1）绿色荧光蛋白（GFP,green fluorescent protein）BFP * * 荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光和发射光频率之差称为斯托克频移。 满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽，从X射线到红外光谱区仍然是荧光。 其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等）也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如：钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。 1.荧光介绍 1）荧光产生及其物理机制 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时，荧光分子处于激发态。 b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。 c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级 d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。 e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。 f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 荧光发光分为内源荧光和外源荧光。 外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。 荧光寿命和量子产率： 荧光猝灭： 荧光能量共振转移： 时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性： 荧光量子点标记，转基因荧光标记 双光子荧光光谱 2）荧光的应用 1）荧光的激发光谱，发射谱 激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大； 荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图? 2 ,? 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如? ‘2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似（振动波函数一样）； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 3 .荧光光