青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立_药学论文.docVIP

青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立_药学论文 青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立_药学论文 【摘要】 　　目的建立并优化青天葵样品总DNA提取方法及随机扩增多态性DNA（RAPD）反应。方法采用改进的高盐低pH法提取青天葵鲜叶和药材样品，通过正交设计和均匀设计，改变反应体系和扩增程序优化随机扩增多态性DNA。结果使用高盐低pH值法可较好地提取新鲜叶片的DNA，药材叶片含杂质较多，但都能用于RAPD。反应体系为：缓冲液2.0 μ1，0.5 μl dNTP（各2.5 mmol·L-1），0.8 μl Mg2+（25 mmol·L-1），0.5 μl引物（20 pmol·μl-1）, 0.2 μl Taq酶（5U·μ1-1），1 μl DNA（50 ng），1μl BSA（20 mg·ml-1），加双倍蒸馏水至20 μl。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；72℃延伸5 min。结论建立并优化了的青天葵样品总DNA提取方法及RAPD反应体系。 【关键词】 青天葵 DNA提取 随机扩增多态性DNA 正交设计 均匀设计 　　Abstract：ObjectiveTo establish and optimize the methods of total DNA extraction and RAPD analysis of Nervilia fordii. MethodsLow pH extraction medium with high salt method was adopted to extract genomic DNA from fresh and medicinal material leaves of Nervilia fordii, and the randomly amplified polymorphic DNAs(RAPD)technique was optimized through changing PCR reaction system. ResultsLow pH extraction medium with high salt was better to extract fresh leaves than medicinal material leaves, but both of them could be suitable to RAPD. The optimal RAPD conditions was as follows: 20μl solution contains 1×Buffer solution, 0.5μl dNTP(each2.5mM)，0.8μl Mg2+(25mM)，0.5μl Primer(20pmol·μl-1), 0.2μl Taq DNA polymerase(5U·μl-1)，1μl DNA(50ng)，1μl BSA(20mg·ml-1)．RAPD program was 3 min at 94℃ for predenaturation，then 40 cycles of 30 sec at 94℃ for denaturation,30 sec at 40℃ for annealing，1 min at 72℃ for extension，finally extension at 72℃ for 5 min．ConclusionThe extraction methods for total DNA and RAPD analysis of Nervilia fordii have been established. 　　Key words：Nervilia fordii; DNA extract; RAPD; Orthogonal design； Uniform design 　　随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorpHic DNA，RAPD)是由Williams和Welsh两个研究小组在不同实验室同时发展起来的一项DNA多态检测技术［1，2］。邵鹏柱等率先使用此分子标记技术鉴定人参［3］。由于不需要对DNA的序列进行测定，随机引物扩增已经广泛用于中药品种及品质的鉴定。 　　青天葵为兰科芋兰属植物毛唇芋兰Nervilia fordii (Hance) Schltr.的叶或带球茎的叶，具有清热解毒、散结消疬等功效［4］。青天葵按商品规格分为大叶、中叶、小叶3个品种，同属植物毛叶芋兰Nervilia plicata (Andr.) Schltr.民间也作为青天葵使用。目前对于青天葵的鉴定大多只限于形态学，尚未