青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序_医学论文.docVIP

青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序_医学论文 青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序_医学论文 【关键词】 青蒿 　　摘要：【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因，为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应（PCR）扩增、 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增、扩增片段与T载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】 通过PCR扩增和RTPCR扩增，分别获得3?590?bp及1?257?bp片段，克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99%，氨基酸序列同源性为100%。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。 　　关键词：青蒿； 鲨烯合酶基因； DNA，重组； 序列分析，DNA 　　青蒿素是我国自主研发的抗疟原虫中药有效单体，对氯奎抗性疟原虫有效，现已成为全球抗疟药的希望。 青蒿素是青蒿经类异戊二烯次生代谢途径所形成的倍半萜衍生物。利用基因工程对青蒿进行基因敲变（knockdown）或敲除（knockout）已成为青蒿遗传改良的两大方向。为了研究在青蒿内导入鲨烯合酶基因反义序列，抑制鲨烯合酶基因表达或除去鲨烯合酶基因使青蒿素合成增加的可能性，我们克隆了青蒿鲨烯合酶基因，并经测序予以证实，为下一步培育转基因高产青蒿植株打下了基础。 　　1 材料 　　11 青蒿（Artemisia annua L．） 采自我国海南省三亚市（由四川引种）。 　　12 试剂 植物DNA提取试剂盒（E．Z．N．A．Plant DNA Kit）、植物RNA提取试剂盒（E．Z．N．A．Plant RNA Kit）均购自 Omega公司；质粒DNA纯化试剂盒（Concert Rapid Plasmid Miniprep System）、DNA片段回收试剂盒（Concert Rapid Gel Extraction System）均购自 Life Technologies 公司； 聚合酶链反应（PCR）扩增试剂盒 （ One Shot LA PCR Mix）及逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增试剂盒（mRNA Selective PCR Kit）均购自 Takara公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。 　　2 方法 　　21 DNA的提取 按植物DNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的DNA。 　　22 RNA的提取 按植物RNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的总RNA。 　　23 引物设计 按GenBank AF405310、AF302464设计引物（SSPri5:5ATGAGTAGTTTGAAAGCAGTATTGAAACAC3；SSPri3:5TTACAAAGTGAATTTCTGCAGAGAGTAAGCA3；SSRNA:5TTACAAAGTGAATTTGATTTTATTGG3），委托Takara公司合成。 　　24 PCR 扩增 以提取的青蒿DNA为模板，SSPri5、SSPri3为上下游引物，用Takara公司的One Shot LA PCR Mix扩增，扩增条件为： 94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。 　　25 RTPCR扩增 以提取的青蒿RNA为模板，SSPri5、SSRNA为上下游引物，用Takara公司的mRNA Selective PCR Kit扩增，扩增条件为： 50℃，30?s→85℃，1?min，50℃，1?min，72℃，5min，30个循环→72℃，10?min→4℃。 　　26 构建重组质粒 将PCR产物及RTPCR产物分别与pTarge T载体（Promega公司）连接，转化DH5α感受态细胞，涂板，蓝白斑筛选重组子。 　　27 重组质粒的鉴定及测序 用Life Technologies公司的试剂盒提取质粒，分别经PCR扩增和EcoRⅠ酶切进行鉴定。PCR扩增采用Promega公司的Tf1酶，反应条件为：94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。最后在 ABI Prism 310 DNA测序仪上用T7启动子引物测序。 　　3 结果 　　31 鲨烯合酶互补DNA（cDNA）扩增 青蒿植株RNA经RTPCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为1?300?bp的DNA区带（见图1）。 　　32 鲨烯合酶基因扩增 青蒿植株DNA经PCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为3?600?bp的DNA区带（见图2）。 　　33 鲨烯合酶基因克隆和鉴定 将扩增片段插入pTarge T载体后，获得重组质粒pTSSD。对 pTSSD 进行PCR扩增，经10?g/L凝胶电