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非小细胞肺癌患者围手术期外周血中肺表面活性蛋白D mRNA的表达及临床意义_医学论文 非小细胞肺癌患者围手术期外周血中肺表面活性蛋白D mRNA的表达及临床意义_医学论文 作者：仲崇俊　蒋庚西　陶国华　王永旺【摘要】 　　［目的］ 探讨非小细胞肺癌患者外周血中肺表面活性蛋白D mRNA（SP-DmRNA）表达在围手术期的变化及其意义。［方法］应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测40例非小细胞肺癌（NSCLC）组织中SP-DmRNA的表达；分别在手术前、关胸时、术后1周检测40例肺癌患者外周血中SP-DmRNA的表达，并以15例肺良性病变患者和10名健康人作为对照。［结果］ 40例NSCLC组织中SP-DmRNA阳性表达率为100%，手术前、关胸时和术后1周外周血SP-DmRNA表达阳性率分别为45.0%、52.5%和15.0%；15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无SP-DmRNA表达。［结论］ SP-DmRNA是检测肺癌外周血微转移良好的分子标志物。 【关键词】 非小细胞肺癌　微转移　肺表面活性蛋白D　围手术期　外周血 　　Expression of Surfactant Protein D mRNA in Peripheral Blood of Non-small Cell Lung Cancer during Peri-operation Period and Its Clinical Significance 肺癌细胞血行播散是肺癌转移、复发的主要方式之一。因未形成显性转移结节，且缺乏临床表现，常规检查方法如影像学、临床病理学方法等难以检测和发现。在肺癌微转移的研究中目前仍缺少公认的特异性分子标记物[1]。Ⅱ型肺泡上皮细胞被认为是肺癌的祖细胞，它能够合成分泌肺表面活性蛋白D（pulmonary surfactant protein D，SP-D），而正常外周血单核细胞中不表达SP-DmRNA[2]。为此，我们选择SP-D作为分子标记物，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测40例非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血，观察围手术期SP-DmRNA的表达变化，以探寻其临床意义。 1 材料与方法 1.1 一般资料 40例NSCLC患者均来源于本院胸心外科，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移，其中，55岁及以上31例，55岁以下9例，男性30例，女性10例，腺癌22例，鳞癌18例。另外选择15例肺部良性疾病患者及10名健康人作为对照组。 1.2 方 法 试剂与引物设计：参照Genbank，采用Primer Premier5引物设计软件设计SP-D基因内外引物，SP-D-U:5′-AAAGTGTCGGGGAGAAGA，SP-D-D:5′-TCAGTCATGCTCAGGAAA，扩增产物长度178bp，内参引物为GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）以检测RNA的完整性，GAPDH-U:5′-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT，GAPDH-D:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，扩增产物长度306bp，由上海生工公司合成。 标本的收集与总RNA抽提：对所有肺癌患者于手术治疗前、手术结束关胸时和手术后1周抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol试剂一步法抽提总RNA，另对手术切除肿瘤于手术室内切取小块新鲜肿瘤组织液氮速冻保存，取约50mg~100mg行总RNA的抽提。 RNA鉴定：对所抽提的总RNA行紫外分光光度计定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。 cDNA第一链合成：取样品总RNA约2μg加入20μl反应体系中，按照试剂盒提供的条件进行逆转录。 巢式PCR扩增SP-DmRNA与GAPDH(内参)按照文献报道方法[2，3]，结合实验优化条件进行。具体为：SP-D PCR反应体系25μl，其中cDNA 2μl,10×PCR buffer 2.5μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.2μl，dNTPmix(2mM/L)2.5μl，MgCl2(20mM/L)1.5μl，SP-D上、下游引物(10pM/L)各1μl，加入适量的双蒸水，使总体积达25μl。反应条件:95°C预变性5min，95°C变性45s，48°C，45s，72°C，45s，共45个循环，在第15个循环末时加入GAPDH上、下游引物(10pM/L)各1μl，最后72°C延伸7min。 PCR产物分析：SP-D扩增产物5μl，加6×loading buffer 1μl混匀上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V恒压，30min，EB染色，在四星凝胶成像系统下拍照和分析。 1.3 统计学分析 使用STATA 7.0统计软件对资料进行分析，相关数据采用χ2检验和Fis