骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系_医学论文.docVIP

骨形态发生蛋白腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系_医学论文 骨形态发生蛋白腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系_医学论文 作者：韩冬，李建军，孙鸿斌，李春雨，王悦书【摘要】 ［目的］探讨骨形态发生蛋白腺病毒表达载体（A recombinant adenoviral vector carrying the human BMP）在成骨过程中和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）相互关系。［方法］应用人骨形态发生蛋白腺病毒载体体外感染兔骨髓间质干细胞（bone marrow stem cells,BMSC），感染后观察BMP、VEGF和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达及钙结节形成。同时将30 μl Ad行裸鼠左后肢肌组织内注射，术后20 d取材，免疫组化和原位杂交法观察BMP与VEGF体内表达情况。30 μl β半乳糖苷酶腺病毒载体（Ad β gal）右后肢肌内注射作为对照。［结果］BMSC被Ad感染后，向成骨细胞分化，上调VEGF的表达。在体内成骨过程中，BMP在软骨细胞、成骨细胞和再生骨组织周围单核细胞表达阳性，VEGF在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞均表达阳性。［结论］BMP和VEGF两者协调一致，互为促进，完成了骨组织的发生。 【关键词】 腺病毒 骨形态发生蛋白 血管内皮细胞生长因子 基因　　VEGF是主要促进血管再生的生长因子，在软骨化骨的再生过程中，发挥着重要的作用，BMP是目前成骨活性明确的诱导因子。但是，由Ad引起的骨组织再生过程中，VEGF所起的作用以及VEGF和BMP两者间的相互关系却知之甚少。本研究将hBMP基因导入到兔BMSC，分析基因感染后BMP对细胞分化和VEGF表达的影响。同时，又将Ad直接注射到裸鼠肌组织内，探讨VEGF在Ad启动的骨组织再生过程中所起的作用及VEGF和BMP两者间的相互关系，为进一步应用基因技术构建血管化的组织工程骨奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 腺病毒载体和细胞株 　　人骨形态发生蛋白腺病毒表达载体（Ad）为E1、E3区缺失的5型重组腺病毒载体，由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士馈赠。携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（Ad β gal）和人胚肾细胞株（293细胞）由吉林大学白求恩基础医学院病理教研室高航博士馈赠。 　　1.1.2 主要试剂 　　DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone）。BMP2和VEGF多克隆抗体和原位杂交检测试剂盒（博士德公司）。X（大连宝生物）。ALP试剂盒（上海虹桥医用试剂研究所）。 　　1.1.3 实验动物 　　BALB/c裸鼠（20～25 g，雌雄不限，中国医学科学院动物所）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 Ad重组腺病毒表达载体扩增、纯化 　　将Ad感染293细胞，待细胞完全出现病变（CPE）后，反复冻融3次，收集溶解产物和细胞，4 ℃ 12 000 r/min×10 min离心取上清收获病毒。氯化铯密度梯度离心法纯化，空斑形成单位测定病毒滴度（PFU）。-70 ℃保存备用。 　　1.2.2 兔BMSC的培养 　　健康日本大耳白兔，（2.0±0.5）kg，3％戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔麻醉。骨髓穿刺针接10 ml注射器，内含稀释的肝素钠2 500U/ml约0.5 ml，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液2～3 ml，2 ml PBS混匀，注入含有4 ml淋巴细胞分层液的试管内，密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min，吸取中间单核细胞层，PBS洗2次，以2×104 /cm2的密度接种于50 ml培养瓶内，加含10%胎牛血清DMEM培养液5 ml。在5%CO2孵箱内37 ℃培养4 d，更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉,继续培养且每周换液2次。12～14 d后基本长满单层,用0.25%胰酶消化，以1×104 /cm2的密度传代培养。 　　1.2.3 Ad感染BMSC 　　BMSC按1×104/孔的密度接种于24孔培养板，待细胞长至近60%融合时，更换为2%胎牛血清DMEM培养液，根据计数的细胞数加入Ad（MOI为100），过夜，次日晨更换5%胎牛血清DMEM培养液继续培养。Ad β gal同等条件下感染检测感染效率。 　　1.2.4 Ad裸鼠体内注射 　　使用2％戊巴比妥钠0.1 ml/只麻醉。双后肢消毒后，微量注射器抽取30 μl Ad（6×108病毒颗粒）于4只裸鼠左后肢近膝关节肌组织内处注射，再抽取30 μl Ad β gal（6×108病毒颗粒）于裸鼠右后