山羊乳腺上皮细胞的体外培养.pdfVIP

山羊乳腺上皮细胞的体外培养 摘 要 为研究山羊乳腺上皮细胞 (GMEC)增殖和分化特性及为生产转基因动物创造条件， 需要建立适合GMEC体外增殖的培养体系。用无菌手术法从健康的泌乳期西农萨能奶山羊 取得乳腺组织进行体外条件下的培养。基础培养液为D-MEM/F-12，含10%胎牛血清，添 加EGF(O.Olmg/L)、氢化可的松O(W L)、孕酮(1mg/L)、胰岛素一转铁蛋白一m钠 (5mg/L)、青霉素(0.05g/L)及链霉素((0.05g/L)。从细胞形态、细胞群体倍增时间、 细胞生长曲线等方面考察了不同生长因子对GMEC的促生长作用。通过有效的细胞培养方 法获得山羊乳腺上皮细胞系，系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分 裂、分化、调亡等一系列形态变化。其结果如下: 1，用组织块培养法可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物;培养的山羊乳腺成纤 维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感，据此可在传代过程中将二者分离纯化，获得纯细 胞系;混合培养物先用0.25%胰蛋白酶在370C消化5-7min所收集的细胞主要为成纤维 细胞;再加0.15%胰蛋白酶 0.02%EDTA消化液在37℃继续消化 5-6min所回收的细胞 绝大多数为上皮细胞，经过2-3代，即可得到纯化的乳腺上皮细胞系。 2.以RPM11640为基础培养液，山羊乳腺上皮细胞在含血清、双抗的同时，添加 氢化考的松、Insulin,IGF-I,E2,EGF及ITS的不同组合，以细胞生长群体倍增值为 参考标准，评估不同组合的生物活性因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响。结果表明: 培养液中添加氢化考的松、IGF-l,EGF及ITS对细胞生长有较明显的促进作用，其倍 增时间是34h. 3.细胞生长曲线表明，传代培养的乳腺上皮细胞在接种后有2d的滞留期，之后为 对数生长期，持续4d左右，第7d进入平台期。 4.GMEC的适宜冻存液为DMEM/F,z，添加30%FCS和 10%的二甲基亚矾 (DMSO)，适宜 的冷冻降温方法是以一10C/min的速度从4℃降至-250C,30min后投入液氮进行低温保 存。 5.GMEC和成纤维细胞混生时分区生长，界限明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状 聚集生长。可以形成网状结构，圆顶形结构。细胞核呈圆形或椭圆形，核仁2-4枚 关键词: 乳腺上皮细胞，西农萨能奶山羊，体外培养 ，乳腺生物器 THECULTUREINVITROOFMAMMARYEPITHELIAL CELLINGOAT ABSTRACT Culturesystem ingoatmammaryepithelialcellwasestablishedtostudythemolecular mechanismofproliferationanddifferentiationingoatmammaryepithelialcell.Themammary tissuesrfomhealthyXinongsaanengoatduringlactationhavebeenculturedinvitro.Thebasicmedium isD-MEM/F-12and 10% fetalcalfserum,andEGF(O.Olmg/L),hydrocortisone(lmg/L),P(lmg/L), ITS(5mg/L),penicillin(0.05g/L)andstreptomycin(0.05g/L)wereadded.Thecellbiological propertiedwereobservedandinvestigatedbyobservingcellpopulationdoublingtimeand cellgrowthcurve. Goatmammaryepithelialcelllineswereobtainedbyculturingtissuerfagment.The appearanceofthesecellswasstudiedbylightmicroscope. 1.Primarycultureofgoatmammaryglandcellscouldbederivedbyoutgrowthofmigrating