ELISPOT法检测特异性抗体分泌细胞地研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 ELI SPOT法检测特异性抗体分泌细胞的研究+ Hi Gu 焦新安，Takashirano，Xin—Xing (1．扬州大学生物科学与技术学院，扬州225009 2．美国国立卫生研究院NIDCD免疫学实验室，马里兰20850) 机体获得性免疫应答包括体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫，免疫应答水平的准确测定是免疫预防、 免疫监测、新型疫苗评价以及免疫学基础研究中的重要工作。数十年来，各种测定抗体、细胞因子或其他 免疫效应分子的技术层出不穷，总体上讲，可分为经典的试管内测定方法(主要是血清学试验)、免疫细 胞的单个细胞分析测定手段和免疫相关分子的分子生物学分析技术等。近年来，酶联免疫斑点试验 仅适用于特异性T细胞应答的测定，而且还用于体液免疫和局部粘膜免疫中特异性B细胞应答的分析， 具有重要的应用价值。 本研究以卡他性莫拉氏茵(Moraxella 定其诱导全身性免疫应答及局部免疫应答中抗体分泌细胞情况，取得了满意的结果。 1．材料与方法 1．1小鼠 6—8周龄雌性BALB／c小鼠，购自TaconicFarm，Inc。 l，2结合疫苗M．catdLOS—CRM结合疫苗由Dr．Gu研制。 作为粘膜佐剂。试验分为免疫组和空白对照组，其中免疫组又分为不同免疫次数处理组。每组6只小鼠。 免疫间隔时间为l周，于最后一次免疫后7天采集样品。 i．4样品采集同法轻度麻醉实验鼠后，腹腔注射10中1Pilocarpine(1 液，每只小鼠可收集100pl左右。其后，放血收集血液样品，以供制备血清；再无菌手术打开口腔，以 20叫1PBS冲洗鼻腔10次，收集鼻腔冲洗液；再用气管插管术以imlPBS冲洗肺脏3次，以获得肺泡 充分振匀15分钟，离心收集上清，作为粪便提取物。所有样品均一70℃保存备用。 1．5淋巴样细胞的制备按文献4，5报道的方法分别制备脾脏、鼻相关淋巴组织(nasally 教育部“高等学校青年教师奖”(175)和教育部留学回国人员科研启动基金资助 376 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 tissues，NALT)，派伊尔氏结(Peyer’s lymphoid patches，PP)，鼻内容物(nasalpassage， NP)和肺脏中的淋巴样细胞。以0．4％台盼蓝计数活细胞。 1．6 25238 ELISPOT在ELISPOT试验前一天，以M．cat LOS作为包被抗原，用含10mM l RPMI (Multiscreen—HA 1640完 全培养基简称CM：RPMI Technolo舀es，Inc)，20ug／ml庆大霉素，5×104M2-巯基乙醇，0．01MHEPES和2mML一谷氨 X X 并作系列倍比稀释。通常每孔5伞1细胞悬液中，含1106，3X105，1105……个细胞。试验中需 Tween一20的去离子水洗涤2次，再用0．05％Tween一20PBS洗涤液洗5次，其后分别加入适当稀释的 晾干。在立体解剖显微镜下，计数特异性蓝色斑点。每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。 1．7 LOS的 对照。试验程序参照Hu等方法。 I．8统计学分析 抗体滴度以几何平均谪度表示。采用两侧检验的t检验进行统计学显著性分析。 2．结果 2．1不同部位特异性抗体分泌细胞的