表皮葡萄球菌粘附机制地研究.pdfVIP

HCL M MLCCCC4002 UULR, 论文汇编 二附属医院、第一附属医院、第三附属医院临床分离的大肠埃希 表1三种基因型的PCR产物在产ESBLs茵株中的分布 菌23株，肺炎克雷伯菌11株，共34株，均经重新鉴定确诊为产 ESBLs的菌株，质控参考菌株大肠埃希菌ATcC25922，肺炎克雷 伯菌ATcC700603来自中国药品生物制品检定所；标准产酶的 TEM—10，TEM-12，‘rEM一29，SHV一1，SHV一7．CTX—M一3型的大肠 埃希菌均为中国协和医科大学北京协和医院陈民均教授惠赠。 订 记 2仪器及试剂：DNA扩增仪为美国PE公司产品，引物由大 连宝生物Takapa公司合成，Taq酶购自Promega公司；dNTPs Mixer等购自上海生工工程公司。 Ser的突变，被命名为SHV一2，各个国家、地区、医院占优势的亚型 二、方法 1细菌质粒DNA提取与PCR扩增：采用碱裂解法提取质 粒DNA[3]，PCR扩增引物：经medline网上基因库核实，其序列分 7一TGC啊AATcAGT_ 别是TEM为：57一TCGGGGHAATGCG一3’和5 74’CGGCCTTCACTCAAGGATG一3 GAGGCACC一37：SHV为5 7和 5’一TCCCGCAGATAAATCACCA一35’一ATGGR— 7；CTX为 RAAAAAATCACTGCGCC-37和5’一TCCCGACGGCT兀’cCGCCTT一 主，存在少量SHv型，并且发现一株菌株同时携带TEM型和 37。PCR反应体积为100{U；其中含lxPCR反映缓冲液，3．5mmol／ sHV型两种亚型的ESBLs耐药基因。 LM矿，2001Lmol／LdNTPs，50011mol／L引物，Taq酶1．6u，lO～lOOng 质粒DNA模板，反应参数为94℃30s，56℃45s，72℃30s循环36 型较少，并检出非TEM型非SHV型。 次，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1O％琼脂糖凝胶电泳， EB染色，紫外灯下观察结果。设大肠埃希首ATCC25922，标准产 酶大肠埃希菌(TEM一10、TEM一12、TEM一29和SHV一1、SHV一7、 CTX—M一3)为对照。 2DNA电泳分析：制备1％琼脂糖凝胶，在熔化的200N1琼 脂糖凝胶中加溴化乙锭20仙l，待温度约为60℃左右倒人制模器 4株，占11．76％，有4株用三种引物扩增耐药基因未能获得阳性 中，并摆好加样梳，待琼脂糖凝胶完全凝固后，小心取出梳子，将 结果，可能还存在其他亚型的ESBL8耐药基因，也不排除这4株 带孔的凝胶置人电泳槽中，使1xTBE溶液完全浸没凝胶并高出 是表型确证法检测中出现的假阳性株。文献报道”大肠埃希菌产 凝胶表面约lmm，取6×溴酚兰加样缓冲液与样品混匀后，依次加 入加样孔中，电压调为100V，电流43mA电泳约1—2小时后，取 有。我们认为未发现SHV型可能与本次分离到的实验菌株中以 出，在紫外投射仪下观察。 大肠埃希菌为主有关。研究中未发现一株细菌同时携带两种或两 结果 种以上的ESBLs耐药基因。 34株产ESBks的菌株经质粒DNA提取，质粒提取后行电泳