固定条件对cRNA探针原位杂交检测影响的研究（P21-23）.pdfVIP

2．仪器设备 (1)落实责任制 (2)定期检查制 (3)适度采购计划 3．科研档案 (1)技术方法 (2)实验资料 (3)实验标本 四、几点体会与启示 1．标准化的实验室建设和管理 2．发达的信息交流和完善的科研文献网络 3．健全的科研社会保障体系 4开放的人才竞争流动机制 5．充足的科研课题和研究经费 6．完善的实验室管理和用人机制 7．活跃的学术氛围和很强的科研协作精神 8．较强的科研创新意识 固定条件对cRNA探针原位杂交检测影响的研究 倪灿荣 第二军医大学长海医院病理科200433 摘耍原位杂交已广泛应用于组织和细胞中DNA和RNA的检测，但是耳存在着许多不确 定因素，例如组织的保存和固定条件，探针的类型和杂交条件；信号放大的敏感性等将直接 影响到1SH的成功率(或杂交信号检测率)，尤其是当应用cRNA探针检测组织细胞中的 和Livin基因cRNA探针，检测5例新鲜乳腺癌组织冰冻切片，观察固定液pH值和固定时 间对ISH结果的影响。结果用碱性4％多聚甲醛固定40rain杂交信号最强，酸性和中性4％ 4％多聚甲醛固定40rain效果最佳，附性信号最强。 冻切片后用pH9．10 Situ 上世纪60年代末，Gall(1969)‘1】和John(1969)‘4首创原位杂交(In hybridization； ISH)检测方法。开创了组织学和细胞生物学研究的新纪元。免疫组化方法可以显示其已经 合成的蛋白质分子，有助于了解细胞类型的特征，丽原位杂交能检测到组织细胞内蛋白质合 成过程中的精确定位。ISH的敏感性和杂交效率取决于如下几个方面：①探针的类型和杂交 条件：②检测方法的敏感性；⑨组织的保存和固定。前二点所涉及的内容已有许多的文献报 21 道。mRNA ISH的成功与否，组织的保存和固定也相当关键，尤其要重视固定的时间和固定 液的pH值。理想的固定应该可以防止组织细胞内mRNA丢失，探针能顺利到达靶RNA， 并与之结合。ISH一般均用多聚甲醛固定组织，以使蛋白质上氨基快速发生交联，从而达到 防止靶mRAN的丢失。在杂交过程中，高温和甲醛胺可以部分除去交联，可以促使探针渗 透，有利于杂交体的形成，但如果处理过度也可使靶RNA降解，因此，杂交温度和固定强 度(固定液的浓度、固定时问和固定液的pH值)比例对于获得理想杂交信非常重要。本文研 cRNA探针，5例 究固定条件对杂交结果的影响，利用二种凋亡抑制基因Survivin和Livin 外科手术切除乳腺癌冰冻切片。 ～、材料和方法 1．标本5例外科手术切除乳腺癌标本，来自本院外科手术标本，液氮速冻，．80。C保 存备用(3个月内)，8um冰冻切片，贴在涂有多聚赖氨的干净载玻片上(该载玻片已180。C烤 0．01mol／L pH7．4 (SGC-7901)购置于上海中科院上海生命科学研究所。 2．试剂 所有试剂均用DEPC水处理，并高压灭菌，器皿180℃烤铀。蛋白酶K购 Mannheim公司。 购于Boehringer 纯化，凝胶电泳鉴定。 4，原位杂交方法口棚(1)杂交前处理8pm冰冻切片经固定，脱水后，PBS洗2×3min， 1％TritonX，100 37℃20min，BPS洗 PBS洗20rain，PBS洗3×5min，蛋白酶K20p酣m 酰胺中48U20min：(3)杂交每片滴加30uI杂交液(50％甲酰胺，5×SSC，0．02％BSA， 250u 50％甲 胺)中于50(2杂交过夜。(3)杂交后洗第二天将切