一神经生长抑制因子(GIF)相互作用蛋白的分子克隆、鉴定与其生物学活性研究.pdfVIP

因组测序(Bao，etaL，2002，Genome (Hypoxanthine-guanine 孢菌的基因组DNA为模板，运用PCR的方法得到的。 HGPRT是嘌呤核苷酸补救途径中的一个关键酶，催化次黄嘌呤／鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸(PRPP) 合成相应的单核苷酸。由于很多寄生虫缺乏与哺乳动物相对应的嘌呤核苷酸从头合成途径，而只能依 靠补救途径生存，从而使HGPRT成为治疗如疟疾等寄生虫病的重要靶点之一。目前这类酶的催化机理 细节仍不是很清楚。通过对HGPRT的蛋白结构与功能的研究，我们可以进一步探讨此类酶的反应机理， 为基于结构的合理化药物设计打下基础。我们对此酶结构研究的另一个目标是希望通过对酶活性部位 关键氨基酸残基的突变，改变其底物特异性，使其能够识别嘌呤类似物或磷酸核糖焦磷酸类似物，从 而合成新的核苷。采用酶促合成的方法，可以弥补化学合成的不足，从而获得大量的核苷类似物，为 开发高效低毒的抗病毒及抗肿瘤药物做准备。 我们成功克隆并表达了HGPRT基因，对它进行了鉴定及初步的酶动力学分析，发现HGPRT在溶液 8．0，70℃。该酶在50。C的半衰期为75分钟，在4C保 中以四聚体的形式存在，最适反应条件为pH and 存3个月活性未见下降(Chen，etaL，2003，ProteinExpression 通过点突变的方法得到10个单突变体及3个双突变体，动力学研究表明，部分HGPRT突变体改变并扩 et 大了底物专一性， 具有催化嘌呤类似物的活性(You 864—872)。同时对提纯的蛋白进行晶体生长试验，得到多种形式的蛋白晶体，并收集了衍射数据(You e芒a1．2003，Acta A，1222空间群，晶胞参 蛋白晶体同晶，衍射分辨率为2．2A；突变体L160I晶体衍射分辨率为1．7 ID：1R3U)。 I 一神经生长gP$lJ因子(GF)相互作用蛋白的分子 克隆、鉴定及其生物学活性研究木 陈巧林1 茹炳根2 (1北京大学人民医院风湿免疫科北京100044； 2北京大学生命科学学院生物化学与分子生物学系蛋白质工程国家重点实验室北京100871) Alzheimer’S病(Alzheimer’Sdisease，AD)最显著的神经病理特征是神经突形成以淀粉样蛋 helix A)为核心的老年斑(senile filament， 白(B-amyloid，B plaque，sP)，由双股螺旋微丝(paired PHF)构成的神经原纤维缠结(neorofibrillarytangles，NFT)以及大量的神经元丧失亿别。尽管目 growth 前还无法确定AD的病因，许多证据表明，神经生长抑制因子(Neuronalinhibitoryfactor，GIF) 含量下降是造成AD脑大量神经元失活的主要因素之一。GIF主要分布于脑部中枢神经系统，在 Alzheimer’S症脑提取物的存在下，对培养的神经元细胞具有特异的生长抑制活性。值得注意的是， 单独的GIF或单独的脑提取物均不具有生长抑制活性，这表明，GIF可能是与脑提取物中的其它因子 协同作用而发挥其抑制功能的盼’4’5’61。迄今，对于GIF发挥抑制功能的分子机制仍不为人知。为深入研 two 究GIF对AD的作用机理，我们首次利用酵母双杂交系统(yeast