乳铁蛋白的分离纯化以与免疫作用的研究.pdfVIP

第六届理事会第二次会议量教学专韭委员会2006年会议论文集 乳铁蛋白的分离纯化以及免疫作用的研究 曲练迭1王术德2侯喜林1朴范泽1 (1．黑龙江八一农垦大学预防兽医学教研室163319；2．东北农业大学预防兽医学教研尘150030) 摘要：乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生理功能，在食 品、医药、饲料和化妆品等领域具有非常广阔的应用前景．本次试验将牛初乳通过离心、盐析后获得的乳 G-loo凝胶层析纯化，获得纯度为920／6的乳铁蛋白，经SDS-PAGD险测分子质 铁蛋白粗提物，通过Sephadex 量约为90，OooDa．将乳铁蛋白添加到新城疫疲苗申免疫雏鸡，实验结果表明乳铁蛋白可以提高疫苗的免疫 效果． 关键词：初乳，乳铁蛋白，分离纯化，免疫 乳铁蛋I刍(Lactoferrin，简称LF)是存在于哺乳动物外分泌液中的一种铁离子结合蛋白， 作用；能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长：调节机体免疫功能， 增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的生长，具有预防及治疗肿瘤的作用：能同多种抗生 素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病[1】。所以近年来对乳铁蛋白的开发利用已引 起人们的广泛关注。 本文建立了实验室分离提纯具有生物学活性的较高纯度乳铁蛋白的技术路线和方法，通 过简单易行的盐析和凝胶层析对新鲜牛初乳进行处理，获得了纯度为92％的乳铁蛋白，分 子质量约为90，000Da；并对其提高机体免疫功能的活性进行了验证性研究，为乳铁蛋白工 业化生产提供技术依据。 1试验材料 G．i00：法玛西亚产分装， 层析柱(50cm×lem)：美国B10L_-RAD公司，填料为Sephadex 泳仪：北京六一仪器厂：低温高速离心机：himac公司；层析仪：美国BIa-RAD公司。牛 初乳(第一天)，大庆市泰康奶牛公寓：乳铁蛋白标准品，SIGMA；标准分子质量蛋白，弗 氏佐剂，上海生工生物工程技术服务有限公司；硫酸铵，分析纯；SDS试剂(电泳级)， 进口分装；实验动物购自东北农业大学孵化厂。 2实验方法 2．1 牛初乳的分离纯化 采集奶牛产犊后24h之内的新鲜初乳进行分离。 乳样前期处理：乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理，即除去脂肪和大量的酪蛋 得到乳清。 盐析：盐析选用硫酸铵沉淀，硫酸铵浓度分别为30％50％80％，主要目的是除去分 40min，除去免疫球蛋白沉淀；再将得到的上清液再次用85％的饱和硫酸铵沉淀30min，此时 需在PH8．5的条件下，4℃，4000r／rain离心40min，此时收集沉淀，并用蒸馏水溶懈。 G．100对LF进行分离和纯化。将 凝胶层析：为了获得较高纯度的LF，选用Sephadex 透析后的乳清lml加入平衡过的凝胶层析柱；在20；C条件下以0．2ml／min的流速进行洗脱， 2．2 LF的鉴定 采用非连续性SDS．PAGE电泳对盐析和凝胶层析所获得的样品进行分子量和纯度的检 测。采用分光光度法对盐析和凝胶层析所获得的样品进行浓度的测定。 2．3免疫活性检测 ．．597．． 牛羊马传染病 · 2．3．1 ND浓缩抗愿 由中国兽医药品监察所提供。鸡新城疫乳铁蛋白弗氏佐剂疫苗、鸡新城疫乳铁蛋白油乳 剂疫苗、鸡新城疫乳铁蛋白弱毒疫苗(LF的含量均为0．1mg／只)；鸡新城疫蜂胶油乳剂疫苗、 鸡新城疫蜂胶弱毒疫苗(蜂胶的含量均为0．1mg／只)；鸡新城疫左旋咪唑油乳剂疫苗、鸡新 城疫左旋咪唑弱毒疫苗(左旋咪唑的含量均为0．1mg／只)：鸡新城疫复方中药油乳剂疫苗、 鸡新城疫复方中药弱毒疫苗(复方中药的含量均为0．1mg／只)；鸡新城疫油乳剂疫苗、鸡新 城疫弱毒疫苗。上述不同疫苗均为自制。 取蛋用型雏鸡120只，分成12组，每组10只，雏鸡10龄颈部皮下分别注射各组疫苗0．2ml， 对照组10龄颈部皮下注射灭菌生理盐水0．2ml；实验组在10日龄同时采用Clone30弱毒苗滴