盐酸金刚烷胺诱导禽流感病毒M2基因变异地研究.pdfVIP

盐酸金刚烷胺诱导禽流感病毒M2基因变异的研究 李艳华1王秀荣‘田国彬1陈化兰1佟恒敏2于康震’ (1哈尔滨兽医研究所，农业部动物流感开放实验室，哈尔滨，150001，2东北农业大学药理教研室，哈尔滨，150030， 农业部畜牧兽医局，100026) 摘要：本研究采用不同年代的4株禽流感病毒，与盐酸金刚烷胺在鸡胚内连续传代，通过对禽流感 病毒M2基因克隆、序歹IJ分析，了解突变情况．N末端、跨膜域、C末端均有氨基酸发生变异。跨膜域突 A／chickcn／xichang／4／96在与盐酸金刚烷胺作用5代后，该毒株在第30位由A突变为T． 关键词：盐酸金刚烷，禽流感病毒，M2基因，基因变异 禽流感(avianinfluenza)是一种严重危害养禽业的病毒性传染病。其病原是正粘病毒科A型流 世界各地爆发，我国也不例外。A型禽流感病毒基因组是单股负链分节段的RNA，由8个节段构成， 组成，分子量大约15KD。它主要是跨膜离子通道蛋白。主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞 M2蛋白的离子通 尔基体内的pH，在病毒脱衣壳时酸化病毒粒子的内部环境(A．T．Hay。1992)， 不管是在试验条件下，还是在临床应用中，耐盐酸金刚烷胺毒株极易被分离到。近年来。禽流 感在我国广泛流行，一些养殖者为了预防及治疗禽流感，大量频繁的使用盐酸金刚烷胺，禽流感病 毒对其产生了耐药性。本研究采用不同年代的4株禽流感病毒。与盐酸金剐烷胺在鸡胚内连续传代， 通过对禽流感病毒M2基因克隆、序列分析了解突变情况。 l材料和方法 1．1材料 1．1．1禽流感病毒 A／Goose／guangDong／1／96(H5NI)(简称醇) Mchicken／xicang／4／96(H9N2)(简称xicang) A／chicken／shanxi／7／98(H9N2)(简称shanxi) Mchicken／Heilongiing／37／02(H9N2)(简称jilin) 1．1．2盐酸金刚烷胺 盐酸金刚烷胺原粉纯度95％。由东北制药总厂生产。 1．1．3引物、菌株及载体 由王秀荣博士后、盂庆文博士、李曦博士惠赠。PMD18．TVector、E．coliJM·109感受态细胞 购于大连宝生物工程有限公司。 1．1．4鸡胚 free)鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 lO日龄SPF(specificpathogen 1．1．5主要试剂 Taq dNTP、IPTG、X-Gal、DNAmarker DL2000均购于Promega公司。小量胶回收试剂盒，质粒提取试 剂盒购于杭州维特洁生化技术有限公司。 1．2 方法 1．2．1病毒增殖 将5株禽流感病毒适当稀释后尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，收获24-72h死胚尿囊液，测血凝 价，分装于冻存管中，-20℃冻存备用。 1．2．2盐酸金刚烷胺最大无毒剂量的确定 1．t m微 用灭菌生理盐水稀释盐酸金刚烷胺，浓度分别为2mg／ml、10mg／ml、20mg／ml。并用0．22 孔滤膜过滤除菌，尿囊腔接种lO日龄SPF鸡胚，记录24--96h鸡胚死亡情况。 1．2．3盐酸金刚烷胺诱导不同亚型禽流感病毒突变 将诱导量的盐酸金刚烷胺与一定稀释浓度的禽流感病毒等量混合后室温作用lh后，尿囊腔接种， 24-72h死胚收取尿囊液，测血凝价。将收获的有血凝价的尿囊液再按上述方法处理，得到与盐酸金 刚烷胺接触不同代次的禽流感病毒。周时设不接触药物的病毒株连续传代对照组。 1．2．4禽流感病毒RNA的提取 禽流感病毒接种子10日龄SPF鸡胚尿囊腔内，收获48h有血凝性的活胚尿囊膜，用研磨器研碎。 其余按Triroi提取试剂盒进行． 1．2．5禽流感病毒M2基因的反转录 参照邓国华的方法进行。 1．2．6 PCR反应 在0．5ml p PCR管中依次加入反转录产物4pl，上下游引物各