石蒜组织培养及超低温保存技术初步研究.pdfVIP

摘要 石蒜(Lycorisspp．)为主产我国的著名观赏及药用植物，近年来存在种质资源 破坏严重，收集、保存与育种相对滞后的问题。组织培养不仅是快速繁殖的有效方 法，同时也是种质保存(超低温保存)及创新的基础。本试验以红花石蒜为代表样 本，对其鳞茎及生长点的组织培养进行研究。同时，对石蒜属植物6个类群的鳞茎 组织培养及红花石蒜其它器官的组织培养进行探索。 除对原生地进行保护，建立种质资源圃外，超低温(．196℃)保存是目前种质 保存最为长期稳定和经济的选择。近年发展的玻璃化超低温保存技术因其简易有效， 正被广泛使用。本试验采用玻璃化法试图建立红花石蒜茎尖的超低温保存技术体系， 得到再生植株，为长期保存石蒜及鳞茎类植物的种质资源提供参考。主要结果如下： ·石蒜组织培养研究 以红花石蒜(Lycorisradiata)的鳞茎切块及生长点为材料，采用不同激素配比的 MS培养基，对离体小鳞茎的分化和增殖进行研究。其中BA3mg／L及NAA1．5mg／L 的培养基，诱导率最高，可达53％，诱导生成的小植株强健整齐，为超低温保存研 究提供适用小鳞茎2000多株。 石蒜生长点在含不同激素的培养基上可形成3种不同类型的愈伤组织，其中在 2,4一D 织产生，转入分化培养基可再生植株，应是进行超低温保存的理想材料。 以红花石蒜为模式植物，对中国石蒜、换锦花、白花石蒜、江苏石蒜、稻草石 蒜、忽地笑等6种石蒜属不同类群的鳞茎进行组织培养。除忽地笑外，其它均可诱 导出芽或小鳞茎，进一步为石蒜属资源的超低温保存平台创造了条件。 对红花石蒜其它器官如叶片、花丝、花药及种子或幼胚的组织培养进行探索， 前期均可诱导出愈伤组织，其中种子及幼叶有再生植株产生。 ·红花石蒜茎尖玻璃化超低温保存技术研究 切取直径1．5111111不同大小的红花石蒜茎尖进行玻璃化超低温保存，其中2-3mm 的石蒜茎尖成活率最高(80％．90％)。茎尖的完整性对成活率及再生率均有影响，带 根芽原基的茎尖组织在恢复培养时可同时发根长芽，长势强。 对比预培养环节中不同浓度蔗糖及不同预培养天数对成活率的影响，结果显示 蔗糖浓度为0．4mol／L培养基上预培养3d时，茎尖成活率最高，达80％；而当蔗糖 浓度为O．7mol／L时，茎尖水渍化不易操作，成活率下降为21％。在1．7d的预培养 时间内，以预培养5d效果最好，成活率达90％。 采用直径2-3mm的石蒜茎尖在蔗糖浓度为0．4mol／L的MS培养基预培养5d， 150min。恢复培养结果表明：处理对间少于30min，由于保护剂处理时间过短，材 料脱水不够，不能成活，随时间延长成活率上升，到80min时成活率可达最高90％， 后又下降。 解冻后茎尖转移至恢复培养基，5．7d后可通过颜色变化，肉眼鉴别是否成活。 约128d后便可见有恢复生长，茎尖不经愈伤组织直接再生，再生率可达53％。 据此，我们得出玻璃化法保存石蒜茎尖的优化程序为：2-3mm的石蒜茎尖在 MS+0．4 浴中快速化冻2min，用MS+I．2mol／L蔗糖液体培养基洗涤20rain，滤纸吸干后接种 到恢复培养基中，暗培养7d后转入正常光培养。 ·超低温保存中活力及遗传稳定性研究 采用TTC法对冻后48h的茎尖活力进行动态测定，结果表明，TTC法对检测冻 后茎尖活力有一定局限性，不能迅速反映出真实活力。但在其后恢复培养过程中， TTC染色程度的变化可一定程度上反映茎尖活力的变化，有一定参考意义。 采用RAPD分子标记对冻后再生植株进行遗传稳定性鉴定，采用24个引物扩增 出百余磊带，与对照没有显著差异，初步说明该保存方法可应用于石蒜资源的长期 稳定保存。 关键词：石蒜；种质保存；组织培养；鳞茎；茎尖；玻璃化法；超低温保存；遗传 稳定性 Ⅱ Abstract Stone all and isboth ornarnentalnative garlic(Lycorisspp．)，which important medicinalin confrontsthe