免疫性血小板减少症患者血清双向电泳图谱的建立及初步分析.pdfVIP

全国中西医结合血液学学术会议 免疫性血小板减少症患者血清双向电泳图谱的建立及初步分析 鲍计章2 周永明1 郭锦荣1 赵心华2 周韶虹1 朱文伟1 胡明辉1 陈其文1 1．上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院； 2．上海中lii药大学基础医学院 【摘要】目的：建立免疫性血小板减少症(1TP)患者血清蛋白质双向电泳图谱，初步分析ITP患 者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法：采用反复冻融法抽提血清蛋白质，以双向电泳技术分离 血清蛋白质。建立邛P患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱，并采用二维电泳图谱专用软件 表达而正常人不表达，有101个蛋白点正常人表达而ITP患者不表迭。结论：通过蛋白质组学技术建 立ITP患者血清蛋白质表达图谱及差异分析，可为进一步鉴定ITP患者血清相关蛋白质、研究ITP的 发病机制及治疗手段提供实验基础。 【关键词】ITP；血清；蛋白质组学；双向电泳 免疫性血小板减少症(immune 导致外周血中血小板减少引起的常见出血性疾病【l。3】，以广泛的皮肤粘膜及内脏出血、血 小板减少、骨髓巨核细胞发育成熟障碍、血小板生存时间缩短及抗血小板自身抗体出现等 为主要特征。本病是血液系统常见病，占出血性疾病的30％14]。本病常反复发作，缠绵 难愈，罕有自发缓解，严重者可因并发颅脑或内脏出血而危及生命，至今尚无理想的治疗 方法。而近几年蛋白质组学的飞速发展为ITP的研究提供了一个新的技术平台。2001年 Science杂志把蛋白质组学列为六大研究热点之一【5J，蛋白质组学研究已经成为21世纪生 达蛋白比较，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立ITP患者和正常人血清总 蛋白质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，为进一步研究ITP发病机制以及 ITP诊断治疗提供实验基础。 1材料与方法 1．1研究病例 的住院ITP患者30例。另设30例来自同期在本院体检的健康人以及招募的健康志愿者作 为正常对照组(既往无血液病及其它免疫性疾病的健康成人，静脉采血前2周内，未患感 染性疾病，未服用糖皮质激素)。空腹安静状态下收集ITP患者和健康正常人静脉血每人 血清lul，．80℃冰箱储存待测。 439 全国中西医结合血液学学术会议 1．2主要仪器 II，AmershamPharmacia 双向电泳系统Multiphor Biotcch(瑞典)公司产品；垂直电 泳仪，Bio．Rad(美国)公司产品；调速振荡器，金坛市富华仪器有限公司产品；超声波 破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度计，Bio．Rad(美国)公司产品； 公司产品；自动凝胶采样系统，Bio．Rad(美国)公司产品；自动平衡离心机，中国产品； 公司产品。 1．3主要试剂 IPG gel Albumin／IgG 腈CAN，Fisher公司产品；三氟乙酸TFA，DIMA公司产品；Trypsin 司产品；基质CHCA，Huka公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。 1．4双向电泳 1．4．1血清总蛋白质的提取及定量 buffer稀释10倍。向去高丰度蛋白柱中加入lml 10min。取上清50微升用binding binding buffer，收集流 buffer，流过柱体。加入稀释后的样品，收集流出液。加600微升binding 出液，重复一次。收集以上2步的流出液，加5倍体积的TCA．丙酮溶液，一20℃过夜沉淀。 4C离心30min，去上清，重 14000rpm4C离心30min，去上清。加90％丙酮，14000rpm 复一次，室温晾干沉淀。加适量裂解液回溶，bradford法测量