中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及序列分析.pdfVIP

中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及序列分析 张曙光张哲文尚德静· (辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁师范大学生命科学学院，大连116029) 【摘要】胰蛋白酶抑制剂是具有胰蛋白酶抑制活性的小分子多肽或蛋白质．本文采用RT-PCR和 5-RACE，首次从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了全长胰蛋白酶抑制剂12cDNA，并应用生物信息学方 等电点8．23．同源性分析显示，中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列与非洲爪蟾、光滑爪 蟾皮肤胰蛋白酶抑制剂具有40％-43％1司源性，与大西洋鲑、红原鸡，褐家鼠胰蛋白酶抑制剂为32Yr43％ 同源，与人腋蛋白酶抑制剂则为37％同源． 【关键词】中国林蛙，RT-PCR，胰蛋白酶抑制剂12基因，cDNA克隆，序列分析 蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物及微生物体内Ⅲ，能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑 制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶，在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的 作用。研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂能参与机体的各种生理活动，如蛋白质折叠、细胞分化、细 胞迁移、细胞基质重建、血压调节、以及肿瘤抑制等…1甜，还可以保护宿主免受病原的感染。目前 已分离得到多种天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在两栖类动物的皮肤分泌物中，也已分离鉴定出几种 区资源优势的经济蛙种，林蛙的皮肤在复杂多变的生态环境中起着调节水平衡、抵抗猎食者、抗菌、 外分泌等多方面的功能n训。中国林蛙皮肤在损伤后不易感染、自愈速度快、修复能力强与其皮肤中 所含活性成分有关。本实验室首次建立了中国林蛙皮肤cDNA文库，发现了高表达的丝氨酸蛋白酶抑 为两栖动物胰蛋白酶抑制剂的进一步开发和利用奠定理论基础。 l材料与方法 1．1材料 中国林蛙(Rana Simple Cells Vector及E．coliCompetentJMl09均购自Takara生物(大连)有限公司。 1．2方法 1．2．1中国林蛙皮肤总RNA提取 RNAiso 使用TaKaRa Reagent提取林蛙皮肤总RNA。 1．2．2中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基因的RT—PcR和5，-RACE 根据已构建的中国林蛙皮肤EST库中的胰蛋白酶抑制剂核苷酸序列，设计并合成引物：GSPh 5LFullRACE GelDNA Kit，进行RT—PcR和5-RACE。用TaKaRa 有限公司合成。使用TaKaRa Agarose PurificationKit Vector连接，热转化至E．coliJMl09 Ver．2．0切胶回收5RACE产物，与pMD20-T Primer 中，挑选阳性菌落，提取质粒并使用BcaBEST M13-47进行序列测定。 1．2．3中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基因的序列分析 利用NCBI数据库对所获得的中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基因的cDNA序列进行同源性分析。 252 亲性等理化性质预测分析。粟用NCBI数据库中的Blast软件进行孩苷酸种氢基酸序列同缚性比较以 及利用http：／／usexpsyorg／toois／、http：／／啊*predictproteinorg／提供的软件T具和 Bnlhewin4 3生物学软件进彳亍氨基酸序列及功能分析。 2结果 2 1中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基田PCR扩增结果 ■ 1 2 3 bp 。器： 勰 圈{中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基因5’RAcE琼脂糖凝胶电泳掰 2．2中国林蛙皮肤胰蛋白酶抑制剂基因eDNA序