胡萝卜高效遗传转化体系建立及遗传稳定性研究.pdfVIP

f肃牧业人学2005同坝I：论文 中文摘要 轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，尤其在发展中国 家，每年受轮状病毒危害的婴幼儿数量非常巨大。目前，列轮状病毒感染最有效的预 防和控制措施，仍是注射疫苗。VP4和VP7是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原， VP6是主要的病毒蛋白，能诱导产生lgG抗体和IgA抗体，与保护性免疫有关。这三 个基因片段是发展基因工程疫苗的首选。 本试验以胡萝卜_F胚轴为受体材制，通过农卡1菌介导法将轮状病毒片段基因 VP4、v陌和VP7转入胡萝1、中，对胡萝h转化体系中的一些关键性的步骤进行了条 件优化，如：下胚轴的浸染时间、共培养吲问、Kan敏感试验、Cab和Cef的刑比试 验等对转化的影响，建立了高效的胡萝h遗传转化体系。主要研究结果如下： 1．用农杆菌浸染7～9d苗龄的胡萝h下胚轴约15min，共培养2～3 J后，转 Kan+500 入＆附加75 Cab的愈伤诱导培养基上，待形成抗性愈伤后， mg／L mg／L Kan+500 mg／L 继代到BI附加100 Cab的抗性芽诱导培养基上，当苗长至2～ mg／L Kan+300 3 Gm时，转入刚加0．1 IBA+75 Cef的生根培养基 mg／L mg／L mg／L 上，2～3周后可得到Kern抗性茧。 VP4基因的Ran抗性植株，有31裸为PCR阳性，阳性率达到38．8％。 3．用塑料稚覆盖并逐渐打丌通风口方法炼苗，抗性植株长势好，抗性强，成活率 提高了35％。低温春化，试验大棚和陆地相比，死亡率降低了49．5％。 blot和Southern 转录。对T．代转VP6和VP7基因的植株分别进行了PCR、PCR—Southern h10t检测，证明目的基因已经整合到胡萝h基因组上。 5．对7个株系n代植株的PCR分析，得出其中两株系接近1：1，另两株系为l： 3。 关键词：轮状病毒；VP4，6，7基因；胡萝h；农杆菌；遗传转化 第iv贝 f肃收业人学2005扁埘I：论义 Abstract is causeef diarrheain R tarjrus RV infectionamajor dehydrating chjldrenalleverthe in andVP4 WOIld．especiallYcountry．VP7 developing are outer and are candidatesforjnclLISion they primary major capsidproteii3 jn a or 1smainvirus induceto subunit hody recombinant．Vp6 protein。can VP7、VP4andVP6 intocarrottO produceantibody．Sointroducing genes develop vaccineofrotavirusesWOUld the edible traditionalmeansof plant change ofveccinesandthecostofvacciDe be production WOUldredured production is withcommercialand greatIY．Ttprovlded meaning prospect． applicative Inthis wereusedastile and study，hypocotyls explant，vp4、vp6vp7genes jntroducedjntOcarrot were tume角ciens1，BA4404．and byAgrobactezium transformationof carrotwereestab¨shed．SUCh genetic system high—efficient J as：Infected eondtj sensitire and times，co—calturalon，Kan experiments．Cab Cefcontrastive resultsindicatedthat： experiments．Thee 1．7d dofco—cultivationand15minofinfection seedling．2 of。system． of KT+75 Mediaresistantcallus：Bj+0．12．4-D+0．2 Kan mg／L mg／L mg／L +500 Cab．Mediaofresistant Cab． Kan+500 mg／L shoots：B^+100 mg／L mg／L of stantroot：B；+0．1IBA