反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素_临床医学论文.docVIP

反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素_临床医学论文 反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素_临床医学论文 【摘要】 以鲫鱼肌肉为材料，建立了一种简便、准确的反相高效液相色谱法，用于鱼肉中伊维菌素的药物残留检测和药代动力学研究。鲫鱼肌肉中的伊维菌素用乙酸乙酯提取，离心后的上清液于45 ℃下氮气吹干，残渣用甲醇水(4∶1，V/V)混合液溶解，正己烷去脂，离心后取下清液，进样20 μL进行HPLC分析。本方法考察了提取剂、柱温和流动相的影响，确定了以乙酸乙酯为提取剂，柱温25 ℃和甲醇水(90∶10，V/V)为流动相的优化条件。方法线性范围为0.025～2.50 μg/g，相关系数r=0.9997，检出限为11 ng/g。批内RSD为1.0%～5.8%，日间RSD为1.0%～7.7%，相对回收率(99.8±4.1)%， 绝对回收率为(95.9±3.9)%。本方法具有操作简便，结果准确可靠的特点。 【关键词】 伊维菌素，鲫鱼，肌肉组织，残留检测，反相高效液相色谱 　1 引 言 　　伊维菌素(ivermectin，IVM)为阿维菌素的衍生物，是目前最优秀的广谱抗寄生虫药之一，具有广谱、高效、用量小、安全等优点，对生物体内外寄生虫，特别是线虫和节肢动物均有高效驱杀作用。1981年投入市场后，在临床兽医中得到了广泛应用。而其在水产养殖寄生虫病害防治方面的应用也引起了人们的关注。目前，动物体内伊维菌素残留的检测方法主要有HPLC检测法[1]和HPLC荧光检测法[2,3]。但这些方法多为家畜样品的药物残留检测，对鱼体内IVM的测定方法研究甚少。Pantelis等[4]利用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)测定了IVM在海鲷内的含量; Zhang等[5]利用液相色谱串联质谱法测定了鳗鱼体内IVM的残留量; 赵思俊等[6]采用HPLC法检测动物肌肉中多种药物残留;沈金灿等[7]采用HPLC法检测动物肌肉中兽药残留。这些方法各具优缺点，样品前处理过程均较复杂，且耗时。本研究以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，采用反相高效液相色谱法分析了鲫鱼肌肉中IVM的残留量。研究结果可为鱼体肌肉组织中IVM的残留检测及药代动力学研究提供参考。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)，配有SPD紫外检测器;SupRa22K冷冻离心机;QGC氮气吹干仪;FSH匀浆机;SK超声波仪;H01漩涡混合器。伊维菌素标准品(Sigma公司);甲醇(色谱纯，Merck公司);乙酸乙酯(色谱纯，Urchem公司);正己烷与无水Na2SO4均为分析纯(国药公司);水为Milli超纯水。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 色谱条件 VP色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为甲醇水(90∶10， V/V)，流速1.0 mL/min。柱温为25 ℃; 紫外检测波长为245 nm; 进样量20 μL。 　　2.2.2 标准溶液的配制 准确称取50 mg伊维菌素标准品于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得1 g/L的标准储备液。精确量取1 mL标准储备液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 mg/L的标准A溶液。精确量取标准A溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.025, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00和2.50 mg/L的系列标准工作液 。 　　2.2.3 样品的处理 称取鲫鱼肌肉组织(1.0000±0.0010) g于10 mL烧杯中，剪碎后加少许无水Na2SO4和3 mL乙酸乙酯，以10000 r/min匀浆30 s，将匀浆液倒入10 mL尖底玻璃离心管A中，以3 mL乙酸乙酯洗涤刀头和小烧杯，将洗涤液全部倒入A管，超声提取10 min，以5000 r/min离心8 min，将上清液倒入另一支10 mL尖底玻璃离心管B中，A管残余物再用5 mL 乙酸乙酯提取一次，涡旋振荡30 s，超声，离心后，合并上清液于B管中，在45 ℃用氮气将B管提取液吹干后，向B管中加入1 mL甲醇水(4∶1，V/V)混合液，超声5 min 使残渣完全溶解，再加入1 mL正己烷，涡旋振荡30 s，3000 r/min离心3 min，取下清液1 mL，以0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液进行RPHPLC检测。 　　3 结果与讨论 　　3.1 样品处理方法的选择和色谱分析条件的优化 　　3.1.1 提取剂的选择 自生物样品中提取IVM的常用提取剂有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通过标准加入实验，测得3种提取剂的平均绝对回收率分别为90.5%, 95.9%和83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物杂质多，对IVM峰的干扰很大。乙酸乙酯和乙腈提取IVM时，基质背景相