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向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究_临床医学论文 向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究_临床医学论文 【摘要】 目的 以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化(MSC作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣为支架，体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)。 方法 羊骨髓穿刺液，以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞(MSCs)，在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增，鉴定；以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架，将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上，体外三维培养，构建组织工程心脏瓣膜，研究细胞功能及组织学结构。 结果 MSC为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列；α、Vimentin、CD及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性，培养上清液NO及ET分别为（165.6±8.9）μmol/L及（50.6±5.6）ng/L，其中NO值明显高于未诱导组（0.05）,猪去细胞瓣膜支架去细胞完全，弹力纤维及胶原纤维保持完整；诱导分化的MSCs在支架上生长良好，形成完整的细胞层。 结论 MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。 【关键词】 内皮细胞； 骨髓细胞； 间充质干细胞； 生物假体； 心脏瓣膜，人工； 组织工程； 绵羊 心脏瓣膜置换手术已经成为终末期心脏瓣膜疾病的主要治疗手段，但目前临床上广泛应用的机械瓣及生物瓣膜远未达到理想程度，而组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve,TEHV）为人工瓣膜的研制提供了一种新的思路，正成为瓣膜外科领域的研究热点。目前国内外研究主要集中于种子细胞来源及支架选择上，其中以正常动脉内皮细胞及骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）研究为著，但动脉内皮细胞创伤大，需牺牲功能血管为代价，而MSCs取材方便，但内皮细胞功能不足，构建的TEHV整体功能尚有欠缺；虽然国内外大量研究均以人工材料为支架来源，但材料科学目前现状尚不能提供一种满意的符合TEHV要求的支架[1。本研究以绵羊骨髓间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后（bone mesenchymal stem cells induced to differentiate to endothelial cells，MSC作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣膜为支架，体外三维构建TEHV,为TEHV的进一步动物体内实验研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM培养基，胎牛血清，0.05% Trypsin美国Gibco公司), Olympus倒置相差显微镜(IX型，日本Olympus公司),Ⅷ因子抗体,α抗体,CD抗体(美国Sigma公司),Vimentin抗体(美国Neomarker公司),一氧化氮(NO)药盒(晶美生物工程北京有限公司),内皮素(ET放射免疫药盒(解放军总医院科技开发中心放射免疫所),纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn),内皮细胞生长因子（ECGF），血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）(美国Sigma公司)。 1.2 MSCs的分离 无菌下在绵羊髂前上棘处行骨髓穿刺，抽出10 mL左右骨髓，以DMEM液稀释1～2倍后，1 500 r/min离心10 min，弃含有脂肪及血小板的上清，再以等量的DMEM液重悬血细胞,沿管壁缓慢加入含10 mL密度为1.073 g/mL的Percoll梯度离心液的离心管内,用水平离心机以2 000 r/min离心30 min，吸取上中层之间的乳白色单个细胞层移入另一离心管中，并以gt;5倍的DMEM液稀释混匀后，2 000 r/min离心10 min，弃上清，加入少量的DMEM液制成细胞悬液，获取MSCs悬液。 1.3 MSC培养及体外扩增 将上述获取的MSCs悬液以2×105 cm-2底面积接种于培养瓶中,加入内皮细胞诱导分化培养液(含10%胎牛血清的DMEM液，VEGF 10 ng/mL，ECGF 10 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，肝素50 IU/mL),置于体积分数为0.05、37 ℃的CO2饱和湿度恒温孵箱中培养，48 h后换液，以后每3天换液1次，当细胞达到80%～90%融合时以0.05% Trypsin+0.02% EDTA消化传代，取第2代细胞进行鉴定，第4代以后用于研究构建TEHV。 1.4 MSCECs的表型鉴定及细胞功能测定 将第2代MSCECs以每孔2×105接种于预置盖玻片的6孔板中，加入培养液1 mL，24 h后取出盖玻片,PBS液冲洗，甲醇固定20 min，常规免疫组化方法，加入αSMA抗体