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基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器_临床医学论文 基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器_临床医学论文 作者：干宁 王鲁雁 李天华 郑 磊 王 峰 【摘要】 在玻碳电极(GCE)表面固定对H2O2有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GCE|CuL);再在GCE|CuL表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物——包膜糖蛋白(gp160)抗体(anti gp160), 由此构建了一类快速检测 gp160的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160溶液中37 ℃下温育30 min后, 传感器表面生成的免疫复合物随gp160浓度的增大而增加, 导致CuL 对H2O2 电催化还原效果降低, 催化电流呈现下降趋势。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下, 催化电流的降低值ΔIo与gp160浓度在1～400 μg/L 呈线性关系; 检出限为0.5 μg/L(3σ)。研制的免疫传感器检测gp160时, 一步免疫反应即可得结果, 较相同条件下包被gp160抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高, 检测范围更宽, 有望用于艾滋病人血清标志物gp160快速筛测。 【关键词】 富马酸二甲酯联吡啶铜, 纳米金, 磁性微粒, 壳聚糖, 艾滋病毒，包膜糖蛋白, 安培免疫传感器 　　1 引 言 　　人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾滋病传播极其重要, 常用的艾滋病诊断方式是抗体检测[1]。在艾滋病毒感染早期, 人体内尚未出现抗体(即 “窗口期”), 已具有很强的传染性[2]。此时，“窗口期”HIV的诊断标志物——包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中, 但含量很低(lt;8 μg/L), 若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期”[3]。目前, 主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量gp160[3], 该法虽然结果准确, 但是操作繁琐、仪器昂贵, 限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点, 已应用于临床检测[4～9]。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法, 且通常需要在反应体系中加入电子媒介体(eT)以加速电子传递, 导致基底干扰并使抗体失活, 限制了其应用[5～9]。近年来, 通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体, 并将其与eT共固定到电极表面, 获得了灵敏度高、无需外加eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器[10～14]。He等[9]通过在电极表面的壳聚糖(Chit)膜上层层电沉积纳米金, 包被癌胚抗原(CEA)抗体, 获得了测定CEA的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金, 比单分子层纳米金吸附更多抗体, 因此在检测CEA时线性范围更宽, 灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作eT, 体系复杂，易导致抗体失活, 且电极表面需多步纳米修饰, 操作繁琐。本研究组在单分散Fe3O4微粒表面负载纳米金, 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒[12]。在每个Fe3O4微粒表面包裹着多个纳米金, 再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体, 扩展传感器检测范围, 提高灵敏度。某些铜配合物具有催化H2O2活性, 可代替H2O2酶被修饰在电极表面制作H2O2传感器[15]。基于以上思路, 本实验合成了对H2O2具有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)[16], 将其与gp160抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在GCE上, 制备了gp160免疫传感电极, 并用于血清样本检验。 2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　CHI电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(φ=2 mm)为工作电极, 铂电极为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极;Easysizer20激光粒度仪(美国欧美克公司);VF型X射线荧光光谱仪(日本岛津公司);PHI射线光电子能谱仪(美国PE公司), Hitachi X扫描电镜(日本Hitachi公司)。 　　直径50～400 nm的Fe3O4微粒(美国Fluka公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit, 脱乙酰度gt;90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒(美国ADL公司)：包括不同浓度(0～500 μg/L)的gp160抗原和单克隆gp160抗体(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA, 96%～99%)与人血清蛋白(HSA, 96%～99%)购自美国Sigma公司。其它试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(美国Millipo