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人cbl 基因真核表达载体的构建及表达_临床医学论文 人cbl 基因真核表达载体的构建及表达_临床医学论文 【Abstract】AIM： To construct the eukaryotic expressing vector of human cbl and test its expression in African green monkey kidney cell line COS7. METHODS: Human cbl gene tagged with flag was amplified from pEFHAcbl plasmid by PCR. The product was cloned into pGEMT easy, sequenced and then subcloned into eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(+). The recombined vector was then transfected into COS7 cells with lipofectin and the expression of cbl gene was detected by Western blot. RESULTS: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl was successfully constructed and its expression in COS7 cells could be detected. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl is constructed and it expresses flagcbl fused protein correctly in COS-7 cells. 　　【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression 　　【摘要】目的： 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法： 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24 bp的flag标签，克隆到pGEMT easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Western blot检测flagcbl在细胞中的表达. 结果： 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论： 成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达. 　　【关键词】 cbl; 聚合酶链反应; 克隆，分子; 基因表达 　　0引言　　Cbl (casitas Blineage lymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl3 3种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl 基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究cbl 对肿瘤细胞生长的影响奠定基础. 　　1材料和方法 　　11材料 　　大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cbl cDNA的质粒由美国La Jolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMT easy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico 公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Weste