人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定_临床医学论文.docVIP

人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定_临床医学论文 人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定_临床医学论文 作者：姜树原 邵国 张胜 黄丽华 龚向峰 周立社 【摘要】 目的：构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1。方法：根据Genebank中人DNMT3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果：PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1。结论：成功构建了人DNMT3B1真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件。 【关键词】 DNA甲基化转移酶3B1;构建;鉴定 　Abstract Objective: To construct and identify the eukaryotic expression plasmid for human pCMV- 2B-DNMT 3B1. Methods: Accord to the published human cDNA sequence in Genebank, a pair of primers were respectively designed and synthesized. The total RNA was isolated from HCT116 cell. After amplification with reverse transcription polymerase chain reaction (RT - PCR), the product was cloned into pCMV- 2B vector. The recombinants were finally sequenced and identified by restrictive endonuclease digestion. Results: pCMV-DNMT3B1 eukaryotic expression vectors was successfully constructed, and it was identified by PCR, double restrictive endonuclease digestion and sequence analysis. Conclusion: The DNMT 3B1 eukaryotic expression vectors was successfully constructed and identified. 　　Key words DNMT 3B1; Construction; Identification 　　DNA甲基化是真核基因组修饰的一种重要方式，DNA甲基化出现于CpG二核苷酸中的胞嘧啶上[1]。真核细胞DNA甲基化由DNA甲基化转移酶(DNMT)催化，目前发现的DNMT有DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B及DNMT3L，其中DNMT1为维持型甲基化酶，DNMT3A和DNMT3B为从头合成型甲基化酶，DNMT3L单独没有活性，但其可以与DNMT3A或DNMT3B相互作用而调节其活性，目前还没有DNMT2的具体功能的报道。在Peter John研究小组的文章中指出，癌症病人样本中发现5/10的DNMT3A上调、6/10的DNMT1上调、8/10的DNMT3B上调，且DNMT3B上调的幅度最大，与对照相比，平均增加7.5倍。因此，DNMT3B在癌症的发生中可能有重要作用[2]。我们成功地构建了DNMT3B1的真核表达载体，为进一步研究DNMT3B的功能奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料和试剂 　　HCT116细胞购于上海细胞所，Trizol购自GIBCOBRL公司，反转录试剂盒购于invitrogen公司，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购于Takara公司，Expand High Fidelity PCR System及rapid ligation Kit购于Roche公司，DNA回收试剂盒购于Qiagen公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 总RNA提取 　　将人HCT116细胞在培养皿中培养至对数生长期,用冷PBS洗涤后,每孔加入Trizol 1mL,吹打均匀后加入200 μL氯仿,混匀,4 ℃、12 000 rpm离心15 min,取上清液,然后加入500 μL异丙醇沉淀,混匀后,室温放置10 min,4 ℃、12 000 rpm离心10 min,沉淀物用70 %乙