人SUMO2基因原核表达、 纯化及多克隆抗体制备_临床医学论文.docVIP

人SUMO基因原核表达、 纯化及多克隆抗体制备_临床医学论文 人SUMO基因原核表达、 纯化及多克隆抗体制备_临床医学论文 【摘要】 目的: 构建人SUMO基因的原核表达载体, 纯化融合蛋白GST并以其为抗原免疫家兔, 制备人SUMO多克隆抗体。 方法: 用PCR的方法得到人SUMO基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST表达; 所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、 SDS电泳鉴定后, 免疫家兔制备抗血清, 分别采用ELISA、 Western blot检测抗体效价和特异性。 结果: 测序证实重组质粒pET41a(+)构建成功;SDS结果证实获得Mr为52 000的GST融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合, ELISA检测为阳性。 结论: 获得了人SUMO蛋白及特异性多克隆抗体, 对进一步研究人SUMO及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。 【关键词】 人SUMO原核表达 蛋白纯化 抗血清 　　随着2004年诺贝尔化学奖授予给发现了泛素调节的蛋白质降解的以色列科学家阿龙·切哈诺沃、 阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯, 近年来, 对依赖于泛素及类泛素蛋白的翻译后修饰的研究成为了新的热点。其中, 小泛素相关修饰物（small ubiquitin与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后修饰形式, 并且在真核细胞的蛋白质修饰中具有重要意义。哺乳动物中发现4种SUMO 分子: 按发现顺序称为SUMO、 SUMO、 SUMO和SUMO。与泛素类似, SUMO也是通过与靶蛋白的结合起作用的, 但与泛素化介导的蛋白酶降解途径不同, SUMO化的结果并不是将蛋白分子降解, 而是通过修饰来增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位, 以及影响蛋白质的转录活性, 从而发挥更加广泛的功能, 比如核质转运、 细胞周期调控以及信号转导等［1］。目前为止, 我们知道的SUMO化修饰的底物还只是一小部分被明确鉴定, 而且我们对已知的SUMO化修饰在改变许多蛋白的稳定性、 定位、 活性等的机理和功能上还存在很多疑问。尤其是对SUMO的具体作用及其与SUMO在功能上的差异还知之甚少, 因而我们通过构建SUMO的原核表达载体, 获得GST融合蛋白并进行纯化, 由此得到人SUMO的特异性多克隆抗体, 为进一步研究SUMO的功能及其与家族其他成员的差异打下了良好的基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒PET、 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3) plysS（本实验室保存）, pEYPF（雷鸣教授惠赠）, 新西兰大白兔（体质量2.5～3.0 kg）2只。 小量质粒提取试剂盒、 DNA纯化回收试剂盒均为博大泰克公司产品; 限制性内切酶Noc I及Xho I, T4连接酶、 Taq DNA聚合酶、 pfuDNA聚合酶、 标准相对分子质量(Mr)蛋白均购自大连TaKaRa有限公司; IPTG购自北京索莱宝科技有限公司; 卡那霉素购自北京鼎国生物工程公司; 硝酸纤维素膜为德国Whatman公司产品; 小鼠GST单克隆抗体（mAb）、 HRP标记的羊抗兔、 兔抗鼠抗体购自北京博奥森生物技术有限公司; GSTbind column购自Amersham公司; 凝血酶购自 Sigma公司; 其他常规试剂为国产分析纯试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物的设计及合成 根据GenBank ( Genbank I D: NM_006936) 中人SUMO基因cDNA序列, 克隆其ORF中活性蛋白区域即其162 bp 至441 bp序列, 设计合成两对引物, 引物序列如下, 第一对上游引物P1: 5′下游引物P2: 5′3′; 其中上游引物含有Nco I限制性酶切位点, 下游引物含有BamH Ⅰ限制性酶切位点。第二对上游引物P3: 5′下游引物P4: 5′其中上游引物含有BamH I限制性酶切位点, 下游引物含有Xho I限制性酶切位点。另为做重组质粒检测用, 又合成了PET41a(+)的通用引物S.Tag primer #699453（记做Ps）:C GAA CGC CAG CAC ATG GAC AGC T7 terminator primer #693373（记做Pt）:ACC GCT GAG CAA TAA CTA GCA引物合成由上海英俊生物工程公司完成。 　　1.2.2 人SUMO2基因原核表达载体pET41a(+)SUMO2SUMO2的构建 以pEYFPSUMO2质粒为模板, 进行常规PCR扩增, 扩增条件为: 94℃预变性3 min, 94℃ 变性30 s