人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备_临床医学论文.docVIP

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备_临床医学论文 人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备_临床医学论文 作者：孙守勋, 李强, 刘静, 李玲, 蒲晓允 【摘要】 目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2（TLR2）胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法: 应用RT方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni亲和层析纯化, 用SDS和 Western blot进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性。结果: 成功构建了pET重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性。结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础。 【关键词】 TLR2; 原核表达; 多克隆抗体; 单个核细胞 Toll样受体作为细胞表面的模式识别受体, 能够对病原体识别、 结合、 引发一系列信号间的转导, 促进各种炎性介质的释放, 对宿主的天然免疫防御具有重要作用, 目前其家族成员至少有11个［1］。TLR与天然免疫应答关系的研究中, 倍受关注的是TLR2和TLR4。其中TLR2识别的配体最多, 可协助TLR4参与人体内对LPS的反应。在TLR2的结构中其胞外区富含亮氨酸的重复序列, 是配体作用的关键功能区域。我们应用RT方法从人外周血单个核细胞中克隆TLR2胞外区基因, 并利用原核表达体系表达该基因的融合蛋白, 制备多克隆抗体并检测其活性, 为进一步研究TLR2胞外区的功能奠定必要的基础。 1 材料和方法 1.1 材料 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司, Tripure购自Roche公司; AMV反转录酶、 Taq酶、 T4 DNA连接酶、 限制性内切酶EcoR I和Sal I均为TaKaRa公司产品; 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自博大泰克公司; LPS、 IPTG、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为Sigma公司产品; 羊抗兔IgG抗体购自北京中山公司, 原核表达载体pET抗His抗体和Ni亲和纯化试剂盒购自Novagen公司, 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3)由本院中心实验室保存。其余试剂为进口及国产分析纯, 实验用仪器和动物为本院和学校中心实验室及实验动物中心提供。引物合成及DNA测序由上海英骏生物公司完成。 1.2 方法 1.2.1 人外周血单个核细胞的分离与培养 在本院检验科门诊收集体检患者的静脉血（EDTA抗凝）, 其各项血液指标均正常, 按操作说明用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞, PBS洗涤后培养于RPMI1640培养液中(含100 mL/L胎牛血清, 脂多糖溶液10 g/L, 青霉素10 万U/L)。细胞经脂多糖刺激培养后, 提取RNA。 1.2.2 总RNA的提取 以Tripure分离试剂提取细胞总RNA, 具体步骤按德国Roche公司的Tripure Isolation Reagent操作说明进行。总RNA-70℃保存。 1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RT）扩增目的片段 由GenBank下载人TLR2全序列, 并根据原核表达载体pET上的多克隆位点采用Primer Premier5.0设计一对TLR2胞外区扩增引物。上游引物为5′GGATGGT3′; 下游引物为5′。其中上游引物的5′端引入EcoR I的酶切位点（下划线表示）, 下游引物的5′端引入Sal I的酶切位点（下划线表示）, 内含启动子ATG和终止密码子TCA。以提取的细胞总RNA为模板, 按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNA。采用降落PCR(Touchdown PCR, TD的方法设置反应条件, 按引物的最小Tm值减5度设定温度梯度。反应条件为: 先在94℃变性3 min后, 94℃, 30 s; 62℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 60℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 57℃, 1 min; 72℃, 1 min; 10个循环, 94℃, 30 s; 55℃, 1 min; 72℃, 1 min; 12个循环, 最后72℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物, 切胶纯化回收目的片段。 1.2.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 用EcoR I和Sal I分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET32a(+)表达质粒, 经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后, 用T4DN