人αsynuclein突变体的克隆及细菌表面展示_临床医学论文.docVIP

人α突变体的克隆及细菌表面展示_临床医学论文 人α突变体的克隆及细菌表面展示_临床医学论文 作者：熊莉丽 赵鹏 郭志云 张建华 茆灿泉 【摘要】 目的 在细菌表面构建及展示人α突变体A30P、E46K和A53T。方法 采用叠套PCR介导的点突变方法，以野生型α为模板。结果 成功克隆了α、E46K和A53T 3个突变型基因，并利用细菌亲密素展示系统将野生型α及突变体A30P、E46K和A53T成功展示在大肠杆菌表面。结论 α及其突变体的细菌表面展示对于α空间结构的良好保持和基于α神经退行性疾病靶分子药物、分子诊断试剂的研发和α蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。 【关键词】 α突变体;生物信息;叠套PCR 　　【Abstract】 Objective To analyze bioinformatics and display of human αins on the cell surface of Escherichia coli. Methods Overlap extension PCR, a rapid and efficient method by sitedirected mutagenesis was introduced to clone the mutants A30P, E46K, A53T of αsynuclein. Results All the three cloned mutants, including the wild type of αsynuclein, were successfully displayed on the surface of E. coli strains based on the Enterohemorrhagic E. coli Intimin EaeA. Conclusions The work would be of great consequence and values for the better maintaining of the spatial structure of αsynuclein and further targeted drug discovery, molecular diagnostic reagents development for neurodegeneration diseases as well for the study of its protein structure and functions. 　　【Key words】 αension PCR 　　Synuclein基因是1988年由Maroteaux教授在电鳗鱼中发现的〔1〕，到目前为止已在人、鼠、兔等多种脊椎动物中发现存在，主要分为α、β和γ大类。其中α是一类广泛分布于神经中枢系统中的可溶性小蛋白，与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关〔2〕。α蛋白主要在神经组织中大量表达，是帕金森病中出现的路易小体的主要组成部分，主要通过蛋白的聚集状态〔3〕、泛素化〔4〕和磷酸化〔5〕等途径来调节其生物活性和生理功能。研究表明α蛋白有分子伴侣的活性〔6〕，在神经递质和多巴胺递质的释放、囊泡运输及调节蛋白酶体活性等方面起着重要的作用〔7〕。Polymeropolos等〔8〕、Kruger等〔9〕和Zarranz等〔10〕分别于1997、1998和2004年在家族性帕金森病遗传家族中发现了A53T、A30P和E46K 3个错义突变蛋白，突变蛋白的表达会导致α蛋白的异常聚集，形成具有疏水性的寡聚体，表现出较强的细胞毒性，这与帕金森病的发病有着密切的关系〔11〕，但这3个突变基因分布在不同帕金森遗传病家族中，较难直接克隆得到。本文在生物信息分析的基础上，首先利用PCR介导的点突变技术，以α野生型基因为模板，克隆了A30P、E46K和A53T 3个突变基因，然后结合细菌展示技术，将野生型α与突变体A30P、E46K和A53T展示于大肠杆菌表面。α在细菌表面的成功展示对于α空间结构的良好保持和基于α的神经退行性疾病靶向药物、分子诊断试剂的研发和蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒与菌株 野生型α基因由美国哈佛医学院的Yankner教授馈赠;细菌亲密素展示载体paskint由德国Christmann教授馈赠;pMD18载体购于大连宝生物工程有限公司;大肠杆菌DH5α为本实验室保存。 　　1.2 试剂 DNA聚合酶KOD Plus购于日本Toyobo公司;DNA聚合酶rTaq、限制性内切酶BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Bgl Ⅱ、T4连接酶购于大连宝生物工程有限公司;αsynuclein抗体购自美国Santa Cruz b