電針后血清抑制TNF-α誘導軟骨细胞凋亡的實驗研究.pdfVIP

鼋针后血清抑制TNF—OL褫尊软骨细胞凋亡的寅骏研究 李西海吴明霞吴赓文到献祥 (福建中臀蘖大挈中西臀结合研究院福州350108) 凋亡程度舆骨性阴饰炎的肢重程度密切相明。在正常生理情况下，软骨细胞存在着凋亡的现象，软骨 细胞的凋亡封於明筇软骨的功能和形熊结樽的雉持有着重要的作用。因此，如何有效抑制软骨细胞凋 亡可能是防治骨性阴筇炎的有效方法之一。本寅骏揉用SD大鼠阴饰软骨建立软骨细胞的髓外培饕 方法，并逗用纽胞生物单的研究方法，觏察鼋针后血清封TNF—d诱尊软骨细胞凋亡的影警。 l寅黢材料 1．1寅黢勤物 臀单寅骇勤物瑕境彀施焉福建中臀单院勤物寅黢中心鼠颊寅黢室，清潆级(合格澄虢：臀勤单第23— 016虢)。 1．2主要试剂及俄器 菌操作塞(AIR 司)；全自勤酶檩俄(BIO—TEK 微镜(Olympus，日本TKO光孥俄器株式舍社)。 2寅黢方法 只)。寅黢组sD大鼠第1、4,7d，揉用水合氯醛麻醉成功后4％木瓜蛋白酶0．2ml筻膝明饰腔注射後 针(脉冲频率8Hz，输出脉冲强度10V)治瘵，15天焉1瘵程，瘵程同休息5天，治瘵2瘵程，共35天。 各组治瘵瘵程结束后，水合氯醛麻醉，腹主勤脉揉集血液，制借含蕖血清。参照按人和勤物篥物等效剂 min等效畴同焉 量换算(给檠削量=酶床常用量×勤物等效面稹系敷)，卦算鼋针干瑗晴同，晦床30 15min。 15 表I寅黢方法 2．2软骨细胞髓外培善及璧定：SD大鼠断颈虚死，燕菌僚件下分雕蔓膝，切取软骨，剪成1×1× lmm3，用0．2％II型廖原酶37℃消化45rain，1000r／rain滩心5rain，收集软骨细胞，重後4次。用 50 DMEM完全培罄液(含10％胎牛血清，维生素Cmg／L和青键霉素各100U／mL)重惑软骨细胞沉 掇，血球扑敷板静敷调整软骨细胞愚液溃度焉(2～3)×105／ml，接獯於培善瓶，倒置颓微镜下靓察软 骨细胞畏满至80％后傅代培善。Ⅱ型腮原免疫组化法，鉴定培蕃的第3代软骨细胞Ⅱ型腾原的表逵， 防性软骨细胞的胞浆中呈棕黄色。 2．3凋亡软骨细胞建立及干预 2．3．1TNF一0【耨谆软骨细胞凋亡：第3代软骨蠡田胞培着72h，随棱分焉4组，分别加人TNF—a 10％FBS 终漉度0斗g／L、5灿g／L、10∥L、20灿g／LDMEM，干预24h，MTr梭测各组软骨细胞的活 性。 2．3．2鼋针后血清干预方法：第3代软骨细胞以1×105／ml傅代接獯於25cm2培善瓶中，细胞 培善72 h，抽笈法随械分焉6组，正常组、模型组、封照组、寅黢1组、寅骏2组、寅骏3组，分别加入含 10％各组血清的DMEM培善24 TNF—alO彬L h，Hocehst33342染色梭测软骨细胞凋亡率。 2．4寅骏指棵的梭测 2．4．1 II型腾原免疫组化鐾定软骨细胞：培饕第3代软骨细胞爬片，PBS冲洗，4％多聚甲醛固定 30min，含0．5％H：02的甲醇室温庭理30rain，蒸馏水洗3次；滴加封团液，室温20 min，甩去余液；滴 加5斗∥IIll漉度的II型腾原罩克隆抗髓，置於瀑盒内4℃遇夜，PBS洗2rain×3次；生物素化山羊抗 兔IgG37℃作用20rain，PBS洗2rain×3次；鲢霉规和素一遇氧化物酶後合物室温30rain，PBS洗 5min x4次；DAB颓色，脱水，透明，封片，光孕须微镜下靓察各组软骨细胞Ⅱ型膨原的表逵情况。 2．4．2MTr梭测软骨细胞的活性：软骨细胞以2×103／孔接獯於96孔板，各孔的终髓蓿均焉200 山，随横分组，按分组不同分别干预后，案除培蕃基，PBS冲洗1次，案除PBS，在每孔中加入0．5％MTI 溶液20一，37℃孵育4h，案除M，I-II，加入15