TaqMan荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立.pdfVIP

第四次猪病学术研讨会会议论文集 TaqMan荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立 陈蓉许大丈魏建忠张玮李郁 (安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036) 摘要根据猪圆环病毒2型(PCv2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqM粕探针，以重组质粒为标准品做 标准曲线，建立了Pcv2的嘲M孤荧光定量PcR检测方法。结果显示：咖M锄荧光定量建立的标准曲线循环阈 值(ct值)与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为O．99652，灵敏度约为2x104拷贝／止，对猪呼吸与繁殖障碍 综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟兔化弱毒无交叉反应．表明本方法快速、敏感、特异性强，具有较高的重复性， 为PCv2的临床检测及基础研究提供技术支持。 关键词猪厦l环病毒2型；1硇M狮；荧光定量PcR circo、rims 猪圆环病毒2型(Porcinetype2，PcV2)是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMws)的 主要病原，并引起机体免疫抑制。PCV2属圆环病毒科圆环病毒属，是’一种小而无囊膜、二十面体、 共价闭合、环状的单股DNA病毒，基因组为1768bp或1767bp。 国内外学者常用普通PCR、间接免疫荧光、免疫组化等方法检测和研究PCV2卜。1。但是，普通 PCR不能对PCV2核酸进行定量，其产物易污染环境。而间接免疫荧光、免疫组化等存在操作复杂、 耗费时间长等缺点。|一时，由于PCv2不引起细胞病变，感染动物不引起明显的临床症状等特性， 使这些方法限制，PCV2的研究。荧光定量PCR方法具有特异性强、定量精确、能有效解决普通PCR 产物易污染等一系列优点。目前荧光定量PCR方法已被用于PCV2组织亲嗜性、病毒持续性感染动 态、免疫机制及PCV2防治效果评价等方面的研究14声J。 n探针、分子信标等； 荧光定量PCR技术可分为两大类：第一类为荧光标记探针，如TaqMa Green和LC 第二类为双链DNA特异的荧光染料，常用的有SYBR GreenⅢ。TaqMan探针法的特异 性比荧光染料法高，成本比其他探针法低。本试验建立了TaqMan荧光定量PCR对PCV2的实时定量 检测方法，并对该方法的灵敏度、特异性、重复性的研究。 l材料与方法 1．1病毒 猪呼吸‘孑繁 技学院传染病研究室保存。 1．2主要试剂和仪器 自上海生工生物工程技术服务有限公司。琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒V3．0购自道普生物科技 Ex (北京)有限公司。Premix vector、普通质粒小提试剂盒均购自宝生生物工 taq、pMDTMl8．T 程(大连)有限公司。其他试剂均为国产分析纯产品。 Rotor．gene3000 Cvcler 见分光光度计购自尤尼柯(上海)仪器有限公司。 1．3引物设计 标记荧光基团标记，37用Eclipse淬灭荧光基团标记，扩增片段长度为146bp。标准品制备引物Al和 作者简介：陈蓉(1986．)，女，在读硕士研究生，主要从事动物传染病的研究。 通讯作者：李郁，E·mail：liyouer@163．c鲫 213 病毒病一猪2型圆环病毒感染 146bp目的片段)。见表l。 表l各引物序列 1．4病料总DNA的提取 参考文献[1】。 1．5标准品制备 rnin，59℃退火1min，72℃延伸1．5min，共35个循环，最后72℃ 件：94℃预变性5min；94℃变性1 延伸10 min。PCR反应体系均为25此：2×TaqMasterMix12．5灿，上下游引物各0．5此，DNA模板5灿，， ddH206．5此。反应结束后，取5此P