白头翁汤治疗炎症性肠病的分子机制研究.pdfVIP

白头翁汤治疗炎症性肠病的分子机制研究 陆树文1刘红菊2赵伟2李莉2顿桓桓2梁超1 1成都中医药大学四川成都(610075) 2中国航天员科聊II练中心北京(100094) Bowel Disease，IBD)是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，主要 炎症性肠病(Inflammatory 包括溃疡性结肠炎(UlcerativeColids，UC)与克罗恩病(Crohn’SDisease，CD)，是胃肠道中除恶 变外最严重的疾病之一。这种疾病通常反复发作，迁延不愈，可有腹痛、腹泻、体重减轻、粘液血 便等表现。IBD西医的传统治疗着眼于控制活动性炎症和调节免疫紊乱，但长期药物维持使用，其 价格昂贵，一般人难以承受。本病属中医“痢疾”、“肠癖”、“肠风”、“泄泻”、“脏毒”等范畴，中医使 用白头翁汤治疗具有临床疗效好、复发率低、不良反应小的优点。目前对于其发病机制研究也取得 了初步进展，实验性IBD小鼠模型中证实，TGF-131在炎症性肠病中的表达增加，但由于过度表达 力。本实验旨在通过观察白头翁汤对造模大鼠的TGF-131及下游信号转导因子Smads的表达变化的 影响，探讨白头翁汤治疗炎症性肠病的分子机制。 1．材料和方法： 1．1实验动物及分组 Wistar雄性大鼠40只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，普通级，体重140-±10 g，随机分 为正常对照组、模型组、模型+阳性对照组、模型+中药中剂量组、模型+中药高剂量组，每组8只。 1．2实验药物及制各 剂量组中药制备：上述药物置于搪瓷药罐中，加适量蒸馏水浸泡2h，加热煮沸30min，滤出头煎， 药渣加蒸馏水适量，再煮沸30min，滤出二煎，合并2次滤液，加热浓缩至浓度为3969／L，原液装 瓶，高压消毒后密封保存。B、高剂量组中药制备：将A组中药继续加热浓缩至浓度为7929／L，原 液装瓶，高压消毒后密封保存。C、阳性对照药美沙拉嗪肠溶片(安徽东盛制药有限公司)，美沙拉 嗪肠溶片碾磨成粉，配成浓度为309／L的混悬液。D、2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4， 6-Trinitrobenzcnesulfonicacid 使用前配制成3．0％TNBS．乙醇溶液(即5％TNBS6ml+无水乙醇4m1)。 1．3主要试剂 Smad7(Santa Cruz)，GAPDH(SantaCruz)，辣根过氧化物酶标记羊抗 Cruz)，p-Smad3(Santa (北京中山生物公司)。 1．4动物造模及取材 制备大鼠炎症性肠病模型：禁食不禁水24 h后，腹腔注射2％戊巴比妥钠(60mg／kg)麻醉，将 直径2mm的乳胶管经肛门轻轻插入大鼠体内大约8cm处的肠腔内，给予2．5％的TNBS一乙醇溶液按 75mg／kg灌肠，然后注入约O．3ml空气，以排空管中的药液，捏紧肛门，提起大鼠尾部，保持倒立 30s，造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。正常对照组给予同体积的生理盐水灌肠，常规饲养。 造模成功3天后，中药治疗组中、高剂量组每日分别给予相应浓度的白头翁汤2ml灌胃治疗，阳性 对照组每日分别给予美沙拉嗪肠溶片混悬液2ml灌胃治疗，每日1次，共14天。正常对照组和模 ．．——549．．．． 型组给予同等体积生理盐水灌胃。第18天处死再组大鼠，剖腹，摘取肛门以上7cm～8cm结肠，沿 肠系膜纵轴剪开，取病变最明显处液氮冻存，用f后续蛋白提取，部分组织置丁4％多聚甲醛固定、 冰冻包埋、切片。 I 5免疫组化： ①组织固定，常规脱水，冰冻切片．丙酮固定；②将切片放置在PBST中，洗3次每次5分钟； @0 拍照。应用hnage．ProPlus6．0软件对图像进行分析。 I6 Westernblot： 释的蛋白浓度分析试剂中，振荡混匀后．595imt波长下测光密度值，以标准蛋白滩度的光密度值作 标准曲线，计算特测样品蛋白裱度；@分别配制12％的分离胶和5％的积层胶，灌制分离胶和积