毕赤酵母表达尿激酶原发酵条件的研究.pdfVIP

毕赤酵母表达尿激酶原发酵条件研究 陈丹蕾李强 (清华大学化学工程系 北京100084) 摘要为了解利用毕赤酵母fPichia pastoris)表达尿激酶原(pro．UK)这个过程的特点．提高 尿激酶原的表达量，奉文利用摇瓶发酵对这个体系进行了研究，确定了中细胞生长和尿激酶原表达 的规律及各物质的消耗情况．并对培养蒂件进行了研究．结果表明．在生长阶段，毕赤酵母的快速 生长期为“12h．18h后生长停止；甘油是细胞生长的限制性因素．在表达阶段，细胞密度变化很 小．两个阶段中，细胞对P043-的需求量都比较大，而对NH。+的利用比较少．不同培养时间的实验 结果证明，将生长阶段缩短至24h是可秆的． 关键词：毕赤酵母，尿教酶原，发酵．表适 血管栓塞性疾病是人类高死亡率的疾病之一。治疗血栓的的常用方法是溶栓疗法。由于目前 临床上常用的溶栓剂缺乏纤维蛋白专一性，大剂量注射会引发内出血，而尿激酶原不缺乏，对纤 溶酶原有特异的亲和力，能选择性激活血栓表面的纤溶酶原，即使大量注射也无出血危险。而且 它在肝脏中的代谢速度也比较理想。因此，尿激酶原具有广泛的应用前景【l】。 目前获得尿激酶原的常用方法是利用P．pastoris基因工程菌发酵表达。利用毕赤酵母表达尿激 酶原可以分为生长和表达两个阶段。详见按照该宿主细胞出产公司的操作手册[2】。本文考察了生 长、表达阶段细胞的生长规律，酶的表达规律及各种营养物质的代谢情况；研究了缩短生长阶段 时间的可行性：通过补加不同原料的对比实验，提出了经济有效的补加策略。 1材料和方法 5。将人尿激酶原基因整合到该宿主细胞的染色 1．1菌种毕赤酵母(Ppastoris)基因工程菌GSll 体上．可以通过甲醇诱导表达尿激酶原。由北京大学国家蛋白质工程中心提供。 I．2培养基 1．2．1平板培养基：葡萄糖2％，酵母氮源碱基O．34％，(NH。)2SO。l％，琼脂1．5％。 1．2．2生长培养基：蛋白胨2％，酵母粉1％，酵母氮源碱基0．34％．(NH4)2S041％，甘油1％-Lys．HCl 0．I％．生物素4·104(种子培养基与生长培养基相同)。 1．2．3表达培养基：将1％的甘油换作2％的甲醇，其它成分同生长培养基。 min，甲醇不需灭菌，在无菌条件下 NaOH或HCl)．在121灭菌20 培养基调pH7．0(用IN 加入。 1-3培养方法 m1种子培养基的300ml锥形瓶中，转速 测定细胞生长曲线：从平板中挑单菌落接至装有30 ml／1000 200 mi瓶，在 rpm，温度28C培养24h：咀5％接种量接入生长培养基中，装液量为100 转速200 达培养基中，24h时补加2％甲醇。在表达阶段，同样每6h取样测定相关数据。 m1／300ml瓶． 优化培养条件：种子培养同上。按5％接种量接入生长培养基中，装液量为30 在转速200 h．24h后按不同的实验目的分别补加部分原料，发酵 rpm．温度28C下培养72h或96 结束后测定发酵液吸光度和尿激酶原的活性。 1．4分析方法 trill下的OD值。尿激酶原活性：纤维蛋白—琼脂糖平板 菌体浓度：吸光度法，测定发酵液在600 176 法[3]。甘油浓度：高碘酸氧化法。N}I。+浓度：靛定酚蓝比色法。P04”浓度：铝蓝比色法[5]。蛋白 浓度：考马斯亮蓝法。 2结果与讨