绿色荧光蛋白基因gfp和抑癌基因p53重组质粒在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达及诱导凋亡的研究.pdfVIP

绿色荧光蛋白基因gfp与抑癌基因p53重组质粒 在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达及诱导凋亡的研究 管世鹤朱俊铭全家妩(武汉生物制品研究所430060) 李 津(北京生物制品研究所100024) 【摘要】为了探讨绿色荧光蛋白基因gfp和p53基因重组质粒在人脑胶质瘤细胞中的表达情况(表达GFP)以 I、Not 及重组质粒如何诱导细胞的凋亡等，以进一步更好地利用GFP作为报道蛋白。本实验采用Kpn I双酶切法 获取约760bp的咖基因片段，插入含野生型p53eDNA的真核表达载体质粒pCEP4-P53的相应酶切位点，经转化感 受态菌，筛选出重组质粒pC凸4-民．GFP；采用非脂质体转染试剂法将重组质粒染人人脑胶质瘤细胞株D2．51；通过 普通光学显微镜观察、荧光显馓镜观察、细胞DNA电泳及TUNEL染色检测U．251细胞的凋亡情况。结果表明构建 的重组质粒pCEP4-％．GFP既能表达GFP，即在荧光显微镜下发出绿色荧光，又能诱导细胞发生凋亡；本实验为GFP 作为报道蛋白及其在生物医学中的进一步更为广泛的应用打下一定的实验基础。 FuGENEn‘6基因表达 【关■词】绿色荧光蛋白基因咖重组质粒U251 脑神经胶质细胞瘤(简称脑胶质瘤或脑胶质细 核细胞中表达。 胞瘤；gliom)在各类颅内肿瘤中约占45％，它是由 神经组织胶质细胞发生的…。野生型p53基因是目 1．2菌株 前已知的与人类肿瘤关系最为密切的一种抑癌基 大肠杆菌JMl09，质粒的宿主菌，本实验室保 因，50％以上的肿瘤中均可检测出p53基因的突存。该菌携带可在真核细胞常规表达的质粒PEGF。 变”1；如果将野生型p53基因导入突变的靶细胞中， PL／CMV和pCEP4-如。 通过替代这种突变或缺失的基因，则产生的正常表 1．3细胞 达产物就可以补充失去正常功能或缺失的蛋白质 人脑胶质瘤细细株U251由13本国立癌中心口 等。为了能够很直观地显示这种外源的野生型p53 野嘉辛教授惠赠。 基因确实已经进入靶细胞，本实验将可作为报道基 2．主要试剂及其配制 因的绿色荧光蛋白基因g昂克隆到含野生型p53基 2．1主要试剂及溶液的配制 因eDNA的表达载体质粒pCEP4．％上，通过新型非 Mannheim (1)限制性内切酶KpnI：Boehringer 脂质体细胞转染试剂FuGENETM6为介导，转染人脑 公司产品(Cat．No．742945)。 胶质瘤细胞株U251，可以通过GFP从而比较方便地 Mannheim (2)限制性内切酶KpnI：Boehringer 检测到野生型p53基因对瘤细胞产生作用，即抑制 公司产品(Cat．No．4014706)。 了细胞的生长，诱导细胞凋亡。为GFP作为报道蛋 (3)FuCEMP6Transfection 白的应用及p53诱导凋亡的理论研究提供实验基 formulation，Boehringer 础。 1815091)。 材料与方法 1．质粒、菌株与细胞 10mmol／L NaCI中，配成 Tris．CI(pH7．5)、15mmol／L 1．1质粒 真核表达质粒pEGFPl2CUV，含Kna／Neo抗性基