食用菌中的dsRNA病毒检测与其基因组研究.pdfVIP

植物病理学研究进展(第五卷) 食用茵中的dsRNA病毒检测及其基因组研究 金波陈集双杜志游陈新爱 (浙江大学生命科学学院。杭州310029) 食用菌在我国的栽培历史悠久，在世界许多国家也有广泛的栽培。随着大规模生产的 发展，病害问题受到人们的关注。由于真菌病毒粒子在食用菌的子实体和菌丝体中以潜伏 状态存在，症状不易辨认，对经济真菌的生产造成了很大的危害。自1950年报道了双孢蘑 France 菇上的“La Disease”以来，世界各地相继出现了各种食用菌病毒的报道。病毒对食用 菌子实体和菌丝体的影响不完全相同，大多数病毒的侵染对寄主并不造成明显的危害，有的 病毒却可使寄主菌丝体不生长或生长缓慢、子实体出现畸形等症状；而且症状的表现也会随 着环境条件的不同而变化。 真菌病毒中大多数是双链RNA病毒，也有少数双链DNA病毒和单链RNA病毒。食用 菌病毒大多数为双链RNA球状病毒，例如，在双孢蘑菇中确认的5种病毒中有4种是球状 有2—3个隔裂的基因组，每个隔裂的基因组又分别被蛋白质衣壳所包被。目前双链RNA bacilli— 病毒仅在真菌病毒中发现，在双孢蘑菇中还有一种单链的RNA杆状病毒Mushroom form 侵染，一般与球状病毒复合侵染。至今仍有陆续的报道发现有未知真菌病毒。尽管对食用 菌病毒的研究开始增多，但是由于真菌病毒的潜伏性，及其混合侵染普遍，对真菌病毒核酸 水平的研究还较少，尤其是食用真菌病毒。至今在Genbank上登录的食用菌病毒基因只有4 种。 本研究利用实验室建立的双链RNA提取和检测方法，对杭州市场上出售的双孢蘑菇、 平菇、金针菇、香菇和草菇等常用食用菌的子实体随机进行双链RNA的检测，结果表明：在 2000bp的dsRNA片段。 BIOTECH)对 990C变性10min的dsRNA dT—Anchor 3’端加Poly(A)；2)以Oligo BIOTECH) 合成第一链eDNA；3)以anehor7G1’I’11℃CCAG代ACGAC primer(5 3’)和随机引物进行PCR扩 vector 增第二链eDNA；4)用低熔点胶法回收纯化浓缩目的PCR产物；5)用pGEM T—easy (Promega)进行目的片段的克隆；6)结合EcoRI酶切鉴定和PCR鉴定筛选和确定阳性克隆； 186 植物病理学研究进展(第五卷) 7)序列测定。现已获得一段458bp的测序结果： T兀TI’CⅨ℃，ICI℃GCGC．ACC兀CI℃O田盯rI’]【℃T兀’CC兀T兀TC聊A !11：1：]mAl-11]]rn：?I℃CA代e￡GAGll’|(yrrTTrll]n[、GTTGC7I℃A 对上述序列通过BLAST搜索、同源性比较，结果表明该段序列与已知数据库中的所有 500bp的克隆尚在测序分析中。 侵染食用真菌的病毒多为dsRNA病毒，病毒侵染通常导致子实体早熟，菌盖小，严重时 不分化出菌盖，菌种严重退化，造成大幅减产；菌丝在培养基或培养料中生长稀疏或紊乱，培 养料菌丝退化严重的部位不结菇，造成菇床出现空缺部位。本研究经dsRNA提取和病毒检 测表明目前杭州市场上的商品化食用菌(包括双孢蘑菇、平菇、金针菇、香菇和草菇等)普遍 受病毒侵染，但大多数真菌病毒表现为隐性侵染，其症状不易辨认或症状时隐时现，对菌种 的危害不能明显察觉，因此，建立方便快速的病毒检测方法是保证无病毒真菌菌种的关键。 进一步研