小檗碱诱导形成的G-四联体对心脏成纤维细胞松弛素表达的影响与机制研究.pdfVIP

北京大学转化医掌论坛暨中国动脉粥样硬化前沿论坛2012 论文摘要j 113 小檗碱诱导形成的G一四联体对心脏成纤维细胞松弛素表达 的影响及机制研究 顾会平，徐明，于海奕，张幼怡，袁g-，高炜(北京大学第三医院心内科，北京100191；北京大学化学与分子 工程学院．北京100871) 【摘要】 背景心肌纤维化存在于多种心血管疾病中，可引起心功能不全、心律失常，甚至心脏性猝死，因此对心肌纤维 化的研究有着重要的理论与现实意义。新近研究表明，松弛素(relaxin，RLn)能够可以防止或逆转多种心脏疾病模型 引起的纤维化。内源性的松弛素水平不足以抑制纤维化的进展，深入了解松弛素的内源性调控机制，有望为心脏纤维 化的药物干预提供新的线索。我们研究发现，在松弛素基因的启动子区存在一段富G序列能够形成G．四联体。G四联体 是由基因组中的一些鸟嘌呤富集区域在单价阳离子作用下折叠而成的非右手螺旋核酸二级结构。G．四联体在调节基因 的方面发挥重要作用。通过对松弛素基因研究，发现在该基因富G序列上游11个碱基处，存在信号转导和转录活化因子 transducersand (signal activators 碱(berberine)又被称为黄连素，属于异喹啉生物碱，小檗碱可以作为G一四联体的配体。本研究观察了G．四联体配体 小檗碱对松弛素基因表达的影响，并对其机制进行了初步探讨，进而证实了小檗碱可以通过促进松弛素基因表达而发 挥抗心脏纤维化作用，研究结果有望为心脏的抗纤维化治疗提供新的线索。 方法分离培养乳大鼠心脏成纤维细胞，用不同浓度的小檗碱处理心脏成纤维细胞，24小时后收取细胞，提取细 time 胞RNA和细胞上清，用RealPCR和ELISA方法分别从RNA水平和蛋白水平观察松弛素基因表达的变化情况。采用 荧光素酶基因报告试验和染色质免疫共沉淀(ChIP)试验，进一步探讨小檗碱影响松弛素表达的机制是否是通过影响 了转录因子STAT与松弛素基因的结合进而影响了松弛素基因启动子活性而实现的。进而采用Westernblot和免疫荧光激 光共聚焦实验观察小檗碱对STAT蛋白表达及其活性改变的是否有影响。采用圆二色谱(circulardichroism，CD)的实 验方法，体外证实，小檗碱可以诱导松弛素基因启动子区富G序列形成G四联体。为了进一步验证，小檗碱可以促进松 弛素基因表达，我们同时观察了小檗碱和外源性松弛素对心脏胶原合成的影响。采用Realtime PCR乖HELISA方法检测了 外源性松弛素和小檗碱对AngⅡ(10。mol／L)引起的心脏成纤维细胞胶原合成的影响；用Westernblot方法检测松弛素 和小檗碱对AngII引起的心脏成纤维细胞c【一SMA表达的影响。在整体实验中，我们用皮下埋泵给AngII的方法建立大鼠 心脏纤维化模型，实验分为生理盐水对照蛳HAngⅡ刺激组[o．8m∥(kg·d)]、Ang lI+RLn组[AngⅡ(0．8mg／(kg·d) 和lrhRLn0．5mg／(kg·d)]、An91I+BBR组[An91I(0．8mg／(kg·d)和小檗碱30mg／(kg·d)腹腔内注射]。术后28天后 测量大鼠的血压和心率，处死大鼠，用天狼猩红染色观察心脏纤维化水平。 结果①与对照组相比，小檗碱呈剂量依赖1陛的促进松弛素的表达和分泌，并且在小檗碱浓度为20gmol／L时与对 照组有明显差异，并且小檗碱能够呈剂量依赖性的增加野生型松弛素报告基因启动子的活性；而对启动子区富G序列进 行点突变的松弛素基因启动子的活性无影响。②与对照组相比，小檗碱能够抑制STAT3与松弛素基因启动子的结合，促 11与松弛素启动子的结合也显著增加。③小檗碱能够诱导松弛素基因启动子区富G序列在260nm处出 进RNA聚合酶pol 现G．四联体的特征峰，并使G．四联体的Tm由67X2提高到77。C，提示小檗碱能够稳定松弛素的G．四联体。④不同浓度的 小檗碱对STAT3蛋白的表达无影响，也不影响P．STAT3的入核。⑤在细胞实验中，结果显示，小檗碱和松弛素都能够抑 time 制AngII引起的胶原的合成和分泌。R