中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化的研究.pdfVIP

2004学术年会 中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化研究+ 李呈军1，井波1，余丹丹1，邓国华1，田国彬1，李雁冰1，于康震2，陈化兰” 1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室，哈尔滨150001 2．全国畜牧兽医总站，北京100026 摘要：H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛流行。我国是在1994年从广东省的一个鸡场 中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒，尽管此后采取了一系列的根除措施，但是由该亚型禽流感 病毒引起的疾病并未得到有效的控制，特别是在1998以后发生了H9N2亚型禽流感的爆发和流行， 使该亚型禽流感病毒在全国范围内广泛分布，给养禽业带来了极其严重的危害。本研究中对 析。结果表明，中国大陆H9N2亚型禽流感病毒主要是欧亚种系，但是也分离到北美种系病毒。多 根据进化分析结果将这”株病毒划分为10个基因型。同时，进化分析表明在进化树中密切相关的 病毒反映出时间参数而不是地域参数，表明病毒出现后并不局限于该区域，而是蔓延到临近的省份 或在全国范围内流行。 关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；遗传演化研究 1 引言 界范围内呈广泛流行的态势，1994至1999年由H9N2 AIV引起的禽流感爆发相继发生于世界各地。通 过对香港活禽市场上分离到的H9N2亚型禽流感病毒进行详尽的抗原性和遗传分析，将欧亚种系H9N2 已经先后在全国各地，从发病鸡、鸭和鹌鹑等家禽体内分离到大量的H9N2亚型AIV(4)， 尤其是 严重的危害，正在越来越严重的威胁着我国养禽业的发展，因此迫切需要对我国的H9N2AIV分离 株进行全面、系统和深入的分析。为了阐明在我国内地流行的H9N2 AIV的遗传演化地位，进行了 本项研究工作。 2材料和方法 2．1病毒 27株H9N2亚型禽流感病毒皆来自有温和禽流感病症的养禽场，病禽表现为咳嗽、喷嚏、产蛋 下降、眼泪、下痢等症状，死淘率升高，并且大部分禽群有细菌混感。采集患病禽病料标本或泄殖 腔、喉头棉拭子，经过病毒纯化，用于本实验研究。 ‘基金项目：“973”项目资助(01999011902，G1999011905)。 作者简介：李呈军(1976一)，男，河北承德人，硕士，现为哈尔滨兽医研究所博士研究生，主要从事禽流感病毒生 物学特性和标记疫苗的研究。 tel／fax：0451 ”通讯作者E—mail：—hlchenl@y—ahoo．corn 2004学术年会 2．2试剂 常用的分子生物学试剂分别购自Invitrogen公司和大连宝生物工程公司 2．3引物 6．0软件设计引物。 根据GenBank中各基因的核苷酸序列，应用Oligo 2．4病毒纯化 所有病毒分离株均用OIE提供的抗血清进行血凝抑制实验和神经氨酸酶抑制实验，证实为H9N2 亚型禽流感病毒，并进行鸡胚三次零点有限稀释纯化病毒。经三次纯化后，以10。稀释接种9—10日 龄SPF胚，48小时后收取鸡胚尿囊液，经杂检证明无污染，作为种毒贮存于一70。C。 2．5全基因组测序和序列分析 用Trisol LS试剂从感染鸡胚尿囊液中提取病毒的RNA，用流感病毒的特异性引物进行反转录， 产生病毒的CDNA，然后利用基因片段特异性的引物进行PCR扩增。PCR产物经电泳鉴定后用 CEQ…DTCS，Quick 8000测序 Start硒t试剂盒进行测序反应，反应产物经过纯化处理后利用CEQTM 包中的Megalign程序进行序列比对和进化分析。 3结果 3．1遗传演化分析 本研究中测定了27株H9N2亚型禽流感病毒的全基因组序列，以系统研究中国大陆H9N2亚型 禽流感病毒的遗传演