PCR技术原理与应用.docVIP

PCR技术原理 一、实验目的：1、理解PCR的技术原理；2、了解PCR的应用领域 二、实验原理： 1 概念 ?PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是模拟体内DNA复制过程，对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。?PCR反应是以4种dNTP为底物，引物引导，DNA聚合酶催化作用下，在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸，多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。 2、PCR反应体系 参与PCR反应的物质主要为包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。 ?2.1 引物 引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应. 引物设计一般考虑以下几个方面： 2.1.1 引物长度 PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，最佳为20～24bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适