丙型肝炎病毒RNA聚合酶活性的研究.pdfVIP

∑7新药开发在中国和世界其它市场 昆泰公司李青 在美国和世界主要药物市场开发一新平均需lo至12年时间，投资5亿美元。 目前世界医药市场以年平均10％的速度增长。1999年世界药物销售额超过3000亿 美无。美国，日本及欧洲是世界主要医药市场：中国是增长最快的市场之—。 报告将探讨中国药品工业走向世界的几条途径： 1)开发自已的专利新药。在中国收集临床前和早期临床数据，以其寻求国内和 国外的进一步投资。 2)作为国外中小型药厂在中国市场的开发。注册，生产及销售伙伴； 3)利用专利过期药开发周期短，费用较低的特点，选择合适产品，开发专利过 期药，进入美国市场； 4)利用传统中药的优势和美国FDA对植物药的优惠政策。将其作为植物类新 药引入美国商场。 入国际市场。 ， 中国科学院武汉病毒研究所r武汉430071) 梁布锋李玮东张东伟龚岷李文良梁钧 通过RT—PCR方式扩增获得全长的HCVNS581．7Kb长片段，分别在大肠肝 · ·133· C‘未端截短的1．2Kb片段，在昆虫细胞中表达的产物仍然具有RNA聚合酶的活 性。通过某些核苷酸的突变，分析酶的活性，发现除了氨基酸序列GDD的改变对 酶的活性有影响外，还有另外3组氨基酸序列对酶的活性的影响。当杆状病毒表达 载体的六组氨酸融合蛋白在N末端和C末端时，分别表达出来的RNA聚合酶具有 不同的酶活性，c—His融合方式表达的酶活注高于N—His融合方式表达的酶，这些 研究提供了—个有用的筛选抗HCV药物的模型。 丙型肝炎病毒(简称HCV)是输血后非甲非乙型肝炎的主要病因。据WHO统 能发展为肝硬化和肝细胞癌。HCV属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病 着关键性的作用。由于HCV基因组的高度变异，目前没有有效的疫苗防治HCV， 也没有有效的、低廉的药物治疗该病。目前主要使用干扰素治疗，由于用药周期很 长，达数月至数年之久，疗效有限，病人花费很大，难以普遍推广该方法，研制有 切相关，研究RdRp的活性及影响酶活性的各种理化和生物学因素，设计出合成的 化学药物，或者寻找和筛选出天然药物，降低或者阻断RdRp的酶活性，是研制抗 HCV药物的主要途径之一。 一、HCVNSSB片段在昆虫细胞中的表达 根据报道的HCV基因组特征，设计引物，通过RT-PCR方法扩增出全长的， NSSB的片段。分别克隆到昆虫杆状病毒载体pBlue 蛋白，N-His)。或者pBlue 然后与线性化的杆状病毒DNA重组，经过空斑筛选，获得重组的杆状病毒。重组 证明重组蛋白分子量为64KD，是我们所需要表达的目的蛋白。用Ni一柱纯化重组 用同样的方法，克隆C末端截短的，长度为1．2kb的NS5B片段，获得的重组融合 ·134· 分别克隆到原核表达载体peTE8中，在大肠杆菌BL21中表达NSSB片段。 二、影响RdRp活性的因素 在原核表达系统中获得的NSSB蛋白，没有检测出RdRp活性。而在昆虫细胞 中表达的NSSB蛋白，无论是全长的、还是截短的都具有RdRp活性，且活性无明 显的差异，说明截短的NSSB蛋白仍保留有RdRp酶活性有效中心部位。但以C末 式可能对酶的空间构象产生差异，从而影响了酶的活性。 著降低。在RdRp酶反应体系中，渗入一定浓度的多聚尿苷酸，会提高RdRp的酶 活性，雨渗入其它的多聚核背酸，如多聚鸟昔酸、多聚艨瞥酸和多聚胞苷酸对 RdRp的活性．无明显的影响。 使用核酸碱基突变技术分析NSSB基因中几组氨基酸序列的变化，对RdRp活 性的影响。在第3 序列是包括很多生物内共有的RdRp酶的保守序列，在其它的生物体内的类似实验 位、283-29 没有明显变化的原因。 四、HCV的RdRp活性研究和抗HCV药物的研制 的病因。尽管最近几年来，HCV的研究受到各国科学家的重视，政府部门和一些大 制药公司都投入大量的人力和物力研究，但HCV的致病机理研究积累的资料仍然 有限。由于没有有效的体外细胞增殖系统，除了猩猩夕l-，也没有易于获得的动物模 型，加之HCV基因组的高度变异，使HCV疫苗的研究进展缓慢。近年来国外的一 些大制