2012.10.27组会报告.pptVIP

* 2012.10.27组会报告 dld hierarch 观点：前列腺素E2（PGE2）可以经由DNA的甲基化作用的途径使得某些抑癌基因和DNA修复基因沉默，从而促进了肿瘤的生长。 DNA methylation 概念：DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式；即在甲基转移酶的催化下，DNA的CpG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶。 作用：DNA甲基化可使基因沉默化，进而使其失去功能。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化， 使DNA 失去核酶限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点， 使染色质高度螺旋化，凝缩成团，从而失去转录活性。 DNA 甲基转移酶分类 DNM T1——持续性DNA 甲基转移酶—— 作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化； DNM T3a、DNM T3b——从头甲基转移酶——它们可甲基化CpG岛，使其半甲基化，继而在DNM T1的作用下全甲基化。 从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。 DNA methyltransferase　　 CPG island CpG island——C、G富集区——通常这些位点很容易发生甲基化 ★在人类基因组内，GC的含量大约为40%；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60%以上，而在另一些区域则只有33%左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。 ★在基因的末端和启动子区域通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”，这些CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。 ★正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象。以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的机制。 通过检测结直肠癌样本中的各自mRNA表达水平发现 PGE2和PGTS2（COX-2）和DNM T1和DNM T3B的表达是相关的 PTGS2——前列腺内过氧化酶2 COX-2（环氧合酶2）——是PGE2的介导物质；当身体组织受到某种刺激如外伤、感染等会活化环氧合酶，能够使花生四烯酸（Arachidonic acid）大量转变为PGE2 等前列腺素。 PEG2——前列腺素2 前列腺素家族的类型之一（前列腺素依据分子结构的不同分为若干类型）；目前已知至少有四种GPCR,即EP1、EP2、EP3和EP4,介导了PGE2的生物学功能。 在LS-147T、HCA7和HT-29细胞中，PGE2的存在能够导致DNM T1和DNMT 3B的表达水平的增高 从而说明PGE2能够导致细胞内部的DNA甲基化水平增高 Western Blot技术的运用 tumor suppressor CDKN2B——Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor B CNR1——cannabinoid receptor type 1 DNA repair gene MLH1——MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 MGMT——Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase 在LS-174T细胞中PGE2导致了抑癌基因CDKN2B和DNA修复基因MLH1启动子区域CGI的甲基化，从而沉默了该基因。 硫化测序PCR（Bisulfite PCR，BSP）技术的运用 在LS-174T细胞中PGE2增强了抑癌基因CDKN2B和DNA修复基因MLH1启动子区域CGI的甲基化水平。 甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP） 目前， 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite sequencing PCR，BSP）。 技术原理： DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T