RNA 干扰的实验方法及应用.pdfVIP

畜牧与兽医 　2007年 　第 39卷 　第 7期 ·65 · RNA 干扰的实验方法及应用 1 2 1 1 1 1 1 吴 　丹 , 章丽娜 , 石 　娇 , 高志峰 , 谭 　克 , 刘 　雷 , 胡 　兰 ( 1. 沈阳农业大学畜牧兽医学院 , 辽宁 沈阳　110 16 1; 2. 沈阳产品质量监督检验院 , 辽宁 沈阳　110022) 摘要 : RNA 干扰 (RNA interference, RNA i) 就是把与内源 mRNA 编码区同源的长度为 19 ～23 bp 的外源双链 RNA ( doub le stranded RNA , dsR NA ) 导入细胞中, 通过一系列细胞内反应引发细胞中相应 mRNA 的降解 , 从而导致特定基因表达沉默的一种技术 。是真核生物中普遍存在的抵抗 病毒入侵 , 抑制转座子活性及基因表达的监控机制 。由于 RNA i可以作为一种简单 、有效代替基因敲除的遗传工具 , 在功能基因组学领域掀起一 场真正的革命 , 并彻底改变这个领域的研究步伐 。本文从 RNA i的发现着手 , 对其原理 、实验方法及应用作了系统介绍 。 关键词 : RNA 干扰 ; 原理 ; 实验方法 ; 应用 中图分类号 : Q78　　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : (2007) 成员结合 , 形成 RNA 介导 的沉寂复合物 ( RNA induced si 1　RNA i技术的发现及发展 lenceing comp lex, R ISC) , 复合体大约为 500 ku , 其组成成分 1995年 , 康乃尔大学的 Su Guo[ 1 ]在利用反义 RNA 技术特 目前还没有完全搞清楚 ; 这种复合物在 A TP 供能的情况下 , 异性地抑制秀丽新小杆线虫 ( C. elegan s) 中的 p ar1基因的 将其携带的双链 siRNA 变成单链 siRNA 分子 , 携带了单链 表达时 , 发现反义 RNA 的确能够阻断 p ar1基因的表达 。但奇 siRNA的 R ISC 就变成 了具有活性 的 R ISC, 这种具有活性 的 怪的是 , 注入作为对照的正义链 RNA , 也同样阻断了该基因 R ISC又被称为 Slicer。Slicer 同目的 mRNA 分子结合 , 会导致 的表达 。对这个奇怪的现象 , 该研究小组一直未能给出合理解 目标 RNA 分子的断裂 , 这些断裂的 RNA 小分子 , 在核酸酶的 释 。直至 1998年 2 月 , Andrew F ire[2 ] 和 Craig M ello 才首次揭 作用下被降解 , 从而导致 目的基因的沉寂 。在线虫和植物中的 开这个悬疑 : Su Guo 遇到的正义 RNA 抑制基因表达的现象 , 遗传学分析表明 , 因为有依赖 RNA 的 RNA 聚合酶 ( RNA de 是由于体外转录所得 RNA 中污染了微量双链 RNA 而引起 , 当 p endent RNA po lym era se, R dRp ) 的存在 , 提出了一个随机降 他们将体外转录得到的单链 RNA 纯化后注射线虫 , 基因抑制 解的 PCR ( random degradative PCR ) 模式 , 亦即 R dRp 以配对 效应变得十分微弱 , 而经过纯化的双链 RNA 却正好相反